NusA技术标签载体pET NusA,pET-44 vector (pET-44a(+), pET-44b(+) and pET-44c(+)

价　　格：¥2930
货　　号：BiovectorNusA.
产　　地：北京

竭诚为您服务！

BioVector NTCC典型培养物保藏中心: 联系人：Dr.Xu, Biovector NTCC Inc.; 电话：400-800-2947 工作QQ:1843439339 (微信同号); 邮件：Biovector@163.com; 手机：18901268599; 地址：北京; 已注册

详细信息
咨询记录(共0条)

pET NusA Fusion Systems 43.1 and 44

Production of soluble, active proteins in E. coli The pET NusA Fusion Systems are designed for cloning and high-level expression of polypeptide sequences fused with the 495 aa NusA (Nus•Tag™) protein. The NusA protein has been identified as having the highest potential for solubility when a data base of more than 4000 E. coli proteins was subjected to solubility modeling (1, 2). Greater than 85% of the expressed protein was soluble in tests with each of four different NusA fusion proteins (1). The pET-43.1 and pET-44 vectors incorporate the Nus•Tag fusion partner and are also compatible with the trxB/gor mutant Origami™ Origami B, Rosetta-gami™, and Rosetta-gami B strains, which facilitate disulfide bond formation in the cytoplasm (2). Disulfide bonded proteins may be obtained by employing the combination of the pET-43.1 or pET-44 vector and these trxB/gor host strains

Features
• N-terminal Nus•Tag fusion partner, systematically identified for high solubility
• Upstream His•Tag^®, S•Tag™ and optional C-terminal HSV•Tag^® and His•Tag fusion tags
• Thrombin and enterokinase cleavage sites
• Multiple cloning sites in all reading frames
• Compatible with Origami, Origami B, Rosetta-gami, and Rosetta-gami B host strains to promote proper folding of expressed protein

1. Harrison, R.G. (2000) inNovations 11, 4–7.
2. Davis, G.D., Elisee, C., Newham, D.M. and Harrison, R.G. (1998) Biotechnol. Bioeng. 65, 382–388.
3. Novy, R. and Drott, D. (2002) inNovaations14, 12–13.

Product Description

The pET NusA Fusion System 44 is designed for cloning and high-level expression of polypeptide sequences fused with the 495 aa NusA (Nus•Tag™) protein. The solubility of many target proteins in the E. coli cytoplasm is increased when they are expressed NusA fusions. The pET-44a-c(+) vectors, which are derived from the corresponding pET-43.1 series, encode an additional N-terminal His•Tag^® sequence for enhanced yields when purifying a target protein with His•Mag™ Agarose Beads from lysates generated with the BugBuster^® HT Reagent and PopCulture^® Reagent. N-terminal S•Tag™ and optional C-terminal HSV•Tag^® and His•Tag fusion sequences are also available for versatile detection and purification of target proteins.

•TB055 pET System Manual
•TB330 pET-44 a-c(+) Vector Map
•pET System Tutorial
•pET Nus•Tag Vectors Diagram
•Certificate of Analysis

Components:

•	10 µg	each pET-44 vector (pET-44a(+), pET-44b(+) and pET-44c(+))
•	0.2 ml	Host bacterial strains BL21, BL21(DE3), and BL21(DE3)pLysS, glycerol stocks
•	0.2 ml	Induction control clone, glycerol stock

NusA技术：显著增强大肠杆菌表达可溶、活性蛋白

前言

NusA融合蛋白表达系统于9年前（1999年）由Davis发明，并在2000年由Novagen首先进行商业化设计和开发，特别推荐用于以NusA作为N端标签时提高在大肠杆菌中难溶的重组表达蛋白的可溶性。NusA融合蛋白表达系统面市至今，已经通过一些高通量表达筛选的评估确认其在可溶性改善方面的有效性。关于NusA融合表达蛋白去除或不去除NusA标签，目的蛋白仍然具有活性的报道也有很多。正是由于NusA标签系统的这种特性，使其成为目前在大肠杆菌表达体系中使用最为广泛的三个融合标签之一（Cabrita，2006）。NusA提高蛋白可溶性的机制一直被研究探讨，已经获得一些认识。本文总结和回顾这些关于NusA系统性能的研究报道。

RealTime ready 智力大冲浪！答对5题，即获赠美国傲仕优质保温杯！

各种“难溶蛋白”与NusA标签重组表达显著提高可溶性

在众多NusA标签融合蛋白可溶性研究报告中，有三篇文章因为其研究所涉及的蛋白的数量多和异源性范围广而得到研究者的重视。这些研究结果被总结在表1中。其中，Shih等（2002）的研究由于包括了来自四个不同物种的目标蛋白而尤为重要。在Korf等（2005）的研究中，他们发现20℃诱导比30℃诱导的NusA标签蛋白有更好的可溶性。另外，使用NusA系统验证，八个较大分子量蛋白（>70kDa）中的七个得到了可溶性表达，而其它的融合标签（GST，MBP和hexahistidine）系统则只得到了四个可溶性表达的蛋白。

表1.用大量的目标蛋白评估NusA标签对提高融合蛋白可溶性的作用

参考文献^a	目的蛋白数目	目的插入序列种属	目标蛋白大小范围	NusA融合蛋白可溶性比例
Shih等（2002）	40	酵母，哺乳动物，植物，昆虫	9-100	60
Korf等（2005）	75	人	6-127	60^b
Kohl等（2008）	96	人	1-118	44^c

a. Korf等和Kohl等的研究中包含了六组氨酸标签。
b. 可溶性蛋白量大于等于10%即认为该融合蛋白可溶。
c. 纯化后的融合蛋白如果在SDS-PAGE后考染在合适位置出现条带即认为可溶。

Korf等的还发现对于定位于真核细胞细胞器，质膜或者骨架的蛋白，相对于其它标签系统来讲，NusA标签是最好的可溶性表达的选择。Kohl等（2008）也发现只要在20-25℃诱导表达，NusA标签能够大大提高难表达的蛋白比如膜蛋白的可溶性。与Korf等的研究结果一致，Kohl等也发现25℃诱导表达比30℃或37℃诱导表达可以纯化得到更多的NusA融合蛋白。

切除NusA标签获得后保持活性且正确折叠的蛋白

表2总结了16个采用NusA标签成功获得可溶性蛋白，在切除标签后这些蛋白仍有正确折叠结构和活性。大部分这种研究是是关于分子量小于或接近20kDa的目标蛋白。纯化后的目标蛋白产量范围在1.5-100mg/L。趋化因子和细胞因子可以得到高达30-100mg/L的产量。其它关于这些蛋白表达和纯化的有参考价值信息包括：

■ 植物磷酸烯醇式丙酮酸—羧化酶激酶（Ermolova2003）——目标蛋白切除标签后用BDA（蓝色葡聚糖）亲和层析树脂纯化。纯化后蛋白的催化活性比未切除标签的融合蛋白高50倍。
■ Xklp3a，Tep3Ag和E8R（De Marco2004）——用蛋白酶切割后，His-融合的TEV和NusA被Ni2+离子亲和色谱选择性去除。与Ni2+亲和结合的标签被紧密地结合在树脂上，在流出液中则可以得到纯化的目的蛋白。所有这三种蛋白在纯化后都正确折叠且均一分散在溶液中。纯化的膜结合蛋白E8R牛痘病毒蛋白在Tris缓冲液中除去NusA后出现了沉淀，然而加入0.02%的月桂酰基麦芽糖苷和150mM的氯化钠后，蛋白又重新变得可溶。
■ 环麦芽糖糊精酶（Turner2005）——这个蛋白属于α-淀粉酶家族。这个家族的蛋白通常在大肠杆菌中很难以活性形式表达出来。将其与肠激酶混合孵育24小时以上会使其活性逐渐增强，直到达到未经肠激酶处理过的融合蛋白的2倍以上，这也说明标签的存在降低了该酶的活性。可以用固化了Cu2+的亲和层析柱去除切除的融合标签。
■ 八种人趋化因子（Magis-trelli 2005）——所有的蛋白都在OrigamiTMB菌株中表达提高它们在胞质中的二硫键形成率。在趋化因子编码序列的C端引入了AviTMTag（亲和素）生物素化序列。切割后的细胞趋化因子可以用单体的亲和素树脂亲和层析与切割下的NusA标签和蛋白酶混合物分离开。所有切割纯化后的蛋白在细胞趋化实验中都显示了活性，而没有一个融合蛋白有这样的活性。
■ 蚯蚓血红蛋白（Karlsen2005）——酶切后，用分子筛分离纯化蚯蚓血红蛋白，纯化后的蛋白通过圆二色谱检测得到的α-螺旋结构与模型预期结果一致，且纯化后的蛋白可以以单体的形式稳定保存。
■ 人白介素-29（Li2006）——用S-蛋白亲和层析比Ni2+亲和层析可以得到更纯的目的蛋白。将融合蛋白N端的NusA/His•Tag®/S•Tag™标签切掉后，用链亲和素琼脂去除生物素标记的凝血酶。用水疱性口膜炎病毒（VSV）处理固定的人羊膜上皮细胞（WISH细胞）后，通过检测纯化的IL-29对细胞的保护效应来检测其抗病毒活性。
■ 人干扰素-λ2（Li2007）——酶切后，用Novagen提供的EKaptureTM琼脂除去重组的肠激酶。先用纯化后的干扰素-λ2处理WISH细胞，24小时后加入VSV病毒，可以观察到干扰素-λ2可以有效地保护细胞免于病毒介导的病变。

表2.切除NusA标签获得后保持活性且正确折叠的蛋白

参考文献	目的蛋白	目的蛋白分子量（kDa）	切割用蛋白酶	融合蛋白亲和层析固定介质	纯化后目的蛋白产量（mg/L）
Ermolova等（2003）	植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶	32	凝血酶	Ni²⁺	1.5
DeMarco等（2004）	Xklp3A Tep3Ag E8R	15 NR^a 32^b	TEV酶 TEV酶 TEV酶	Ni²⁺	5.0 2.5 4.0
Turner等（2005）	环麦芽糖糊精酶	69	肠激酶	Cu²⁺	1.6
Magistrelli等（2005）	八种人趋化因子	8-21	Xa因子	Ni²⁺	30-100
Karlsen等（2005）	蚯蚓血红蛋白	15	TEV酶	Ni²⁺	NR^a
Li和He（2006）	人白介素-29	20	凝血酶	S-蛋白	60
Li和Huang（2007）	人干扰素-λ2	20	肠激酶	Ni²⁺	65

a. 未报道
b. 根据NCBI报道预测的全长蛋白分子量

与NusA标签融合且具有活性的蛋白

与这些切除NusA标签后保持活性且正确折叠的蛋白不同，还有很多报道指出目的蛋白在“NusA-目的蛋白”的融合形式时具有很好的活性。比如单链（ScFv）催化活性抗体14D9（Zheng2003），来自Aequorea victoria的绿色荧光蛋白（Nallamsetty2006），人二氢叶酸还原酶（Nallamsetty 2006），来自Ensis directus蛏子的精氨酸酶激酶（Compaan2003），来自B. thuringiensis的修饰δ-内毒素（Kumar 2005），人BCMA跨膜受体（Guan2006），植物α-双加氧酶1（Liu 2006），以及来自Plasmodiumfalciparum的b-ketoacyl-acyl载体蛋白合成酶（Lack2006）等，反映了各种不同背景的蛋白都显示出了与NusA标签融合后的活性。

NusA标签提高蛋白可溶性的可能机制

Houry（1999）等揭示NusA蛋白是分子伴侣GroEL在体内的必须底物。而GroEL与其共作用因子GroES是大肠杆菌唯一的在所有生长条件下必需的分子伴侣系统。Douette等（2005）研究了融合蛋白NusA-UCP1（uncouplingprotein1）的可溶产量。UCP1是一种线粒体膜蛋白。这些作者发现16℃培养时，当GroEL共过表达的情况下，融合蛋白的可溶性有更大的提高。这个结果也表明NusA与分子伴侣途径相作用，从而阻止参与蛋白的聚集。
总结

已有充分的证据证明NusA标签系统能显著提高多种不同来源蛋白的可溶性表达，而这些蛋白在单独表达时往往形成不可溶的包涵体。在一些研究报告中，用蛋白酶切除NusA标签能使目的蛋白仍保持正确折叠和生物学活性；相反，在另外许多报道中也指出当目的蛋白与NusA融合而非切除时，融合蛋白也同样具有活性。NusA标签系统的成功至少部分地是由于其与大肠杆菌分子伴侣系统相互作用的结果。

参考文献
Cabrita, L.D., et al. 2006. BMC Biotechnol. 6, 12.
Compaan, D.M. and Ellington, W.R. 2003. J Exp. Biol. 206, 1545.
Davis, G.D., et al. 1999. Biotechnol. Bioeng. 65, 382.
De Marco, V., et al. 2004. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322,766.
Douette, P., et al. 2005. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333,686.
Ermolova, N.V., et al. 2003. Protein Expr. Purif. 29, 123.
Guan, Z.B., et al. 2006. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 22, 46.
Houry, W.A., et al. 1999. Nature 402, 147.
Karlsen, O.A., et al. 2005. FEBS J 272, 2428.
Kohl, T., et al. 2008. Proteome Sci. 6, 4.
Korf, U., et al. 2005. Proteomics 5, 3571.
Kumar, S., et al. 2005. J Inverteb. Pathol. 88, 83.
Lack, G., et al. 2006. J Biol. Chem. 281, 9538.
Li, M. and He, S. 2006. J Biotechnol. 122, 334.
Li, M. and Huang, D. 2007. Biotechnol. Lett. 29, 1025.
Liu, W., et al. 2006. Plant Physiol. Biochem. 44, 284.
Magistrelli, G., et al. 2005. Biochem. Biophys. Res. Commun. 334,370.
Nallamsetty, S. and Waugh, D.S. 2006. Prot. Expr. Purif. 45,175.
Shih, Y.P., et al. 2002. Protein Sci. 11, 1714.
Turner, P., et al. 2005. Prot. Expr. Purif. 39, 54.
WilkInson, D.L and Harrison, R.G. 1991. Biotechnol. (N.Y.). 9,443.
Zheng, L., et al. 2003. J Biochem. 133,577.