EHA105根癌农杆菌菌株/感受态细胞-BioVector NTCC质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心

Agrobacterium tumefaciens EHA105根癌农杆菌菌株及感受态细胞

-BioVector NTCC质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心

Resistance抗性: Rifampicin 20ug/mL Sm:50 ug/mL. Store:4℃

基因型

C58 (rif R) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) (strepR) Succinamopine

产品说明

EHA105 菌株由 EHA105 菌株改造而来，为 C58 型背景，核基因中含有筛选标签——利福平 抗性基因 rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型 Ti 质粒 pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) ，此质粒含有 vir 基因（vir 基因是 T-DNA 插入植物基因组必需的元件， pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的 T-DNA 转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载 体 T-DNA 顺利转移）。pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)型 Ti 质粒含有筛选标签：strep，赋予 EHA105 菌株链霉素抗性，适用于水稻、烟草等植物的转基因操作.

操作方法

1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。1. 每100μl感受态加1ug（体积不大于10ul）质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。3. 加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2~3小时。4. 6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50ug/ml kan 时，28℃培养48h即可；平板中同时加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 则需要28℃培养72-90h）。注意事项1. 感受态细胞最好在冰上融化。2. 混入质粒时应轻柔操作。3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

备注： 1、农杆菌相关抗生素配方：

抗生素

配方

原液

工作液

羧苄青霉素（carb）

双蒸水溶解，0.22um滤膜过滤除菌

50mg/ml

50ug/ml

硫酸卡那霉素（kan）

双蒸水溶解，0.22um滤膜过滤除菌

50mg/ml

50ug/ml

链霉素（strep）

双蒸水溶解，0.22um滤膜过滤除菌

10mg/ml

50ug/ml

利福平（rif）

DMSO溶解，0.22um滤膜过滤除菌

10mg/ml

20ug/ml

庆大霉素（gent）

双蒸水溶解，0.22um滤膜过滤除菌

20mg/ml

40ug/ml

2、常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

农杆菌菌株

羧苄青霉素(carb)

链霉素(strep)

利福平(rif)

庆大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

R

R

S

S

EHA105

S

R

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

R

R

R

S

3、LB及YEB配方：

component

LB(液体)/L

LB(固体)/L

component

YEB(液体)/L

YEB(固体)/L

Tryptone

10g

10g

Tryptone

5g

5g

Yeast extract

5g

5g

Yeast extract

1g

1g

NaCl

10g

10g

牛肉浸膏

5g

5g

NaOH

调PH到7.0

调PH到7.0

蔗糖

5g

5g

Agar

－

15g

MgSO4*7H2O

0.49g

0.49g

NaOH

调PH到7.0

调PH到7.0

Agar

－

15g 注意事项1、加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10 ；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。2、混入质粒时应轻柔操作。3、转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。4、利福平浓度不应高于25ug/ul，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif则转化效率降低到1/2。5、培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低（可以忽略）。