BioVector® pTTB1 表达质粒 / pTTB1 Vector

一、 背景与来源说明 / Background & Origin

pTTB1 是一种专门设计用于大肠杆菌（E. coli）或产气肠杆菌等原核表达系统的高效表达质粒/载体。作为 pTT 系列工程载体的衍生衍生株，pTTB1 通常整合了调控型强启动子（如 lac、tac 或 T7 启动子系统）、多克隆位点（MCS）以及方便纯化的融合标签（如 N 端或 C 端 6xHis-tag、Flag-tag 等）。该载体用于目的基因的克隆、高效重组蛋白表达、酶工程修饰以及工业级发酵研究。

二、 质粒主要结构与生物学特征 / Biological Characteristics

• 载体类型 / Vector Type：原核蛋白表达载体 (Bacterial Expression Vector)

• 表达宿主 / Expression Host：E. coli 表达菌株（如 BL21(DE3)、DH5alpha、JM109）

• 细菌筛选标记 / Bacterial Selection Marker：氨苄青霉素 (Ampicillin, 100 ug/mL) 或 卡那霉素 (Kanamycin, 50 ug/mL)

• 核心元件构成 / Key Functional Components：

  • 强启动子 (Promoter)：如 lac / tac / T7 启动子，受 IPTG 诱导调控

  • 核糖体结合位点 (RBS / Shine-Dalgarno)：保障 mRNA 高效起始翻译

  • 多克隆位点 (MCS)：提供多个单一限制性内切酶切位点，便于外源 CDS 基因插入

  • 融合标签 (Tags)：常见的 N/C 端 His-tag / GST / S-tag，利于后续蛋白亲和纯化

  • 转录终止子 (Terminator)：T1T2 或 T7 终止子，保障 mRNA 转录稳定终止

  • 复制起点 (Origin of Replication)：pUC 或 pBR322 复制起点，保证质粒在宿主菌中的复制与拷贝数

• 应用领域 / Applications：外源重组蛋白高水平表达、酶制剂工程、蛋白质相互作用及结构生物学研究

三、 培养条件与操作指南 / Culture & Handling Protocols

1. 质粒扩增与构建 / Cloning & Propagation

• 克隆宿主 / Cloning Host：E. coli DH5alpha 或 TOP10

• 培养基 / Broth & Agar：LB 液体/固体培养基 + 对应选择性抗生素（如 100 ug/mL Amp 或 50 ug/mL Kan）

• 转化步骤 / Transformation：

  1. 取 50 uL DH5alpha 感受态细胞于冰上融化，加入 1 uL 质粒 DNA（约 10-50 ng）。

  2. 冰浴 30 分钟，42 摄氏度热休克 45 秒，立即置于冰上 2 分钟。

  3. 加入 500 uL 无抗 LB 培养基，37 摄氏度复苏摇菌 1 小时。

  4. 离心重悬后涂布于含对应抗生素的 LB 培养皿，37 摄氏度过夜培养。

2. 蛋白重组表达与诱导 / Protein Expression & Induction

• 表达宿主 / Expression Host：E. coli BL21(DE3)

• 诱导与表达步骤 / Induction Protocol：

  1. 将正确接菌的质粒转化入 BL21(DE3)，挑取单菌落接种于含抗生素的 LB 液体培养基中过夜培养。

  2. 按 1:100 比例转接至大容量发酵 LB 培养基中，37 摄氏度震荡培养至 OD600 达到 0.6 至 0.8。

  3. 加入终浓度为 0.2 至 1.0 mM 的 IPTG，在 37 摄氏度诱导 3-4 小时（或 16-25 摄氏度低温诱导过夜以增加可溶性蛋白比例）。

  4. 离心收集菌体沉淀，裂解后通过 Ni-NTA 亲和层析柱进行重组蛋白纯化。

四、 技术指标简表 / Technical Data Summary

BioVector® pTTB1 Vector

1. Background and Origin

pTTB1 is an engineered prokaryotic expression vector derived for high-level recombinant protein expression in Escherichia coli and related bacterial systems. Designed with optimized transcription and translation control elements, pTTB1 contains a strong inducible promoter, a multiple cloning site (MCS), and optional affinity tags (such as His-tag). It is widely utilized for cloning target genes, producing functional recombinant proteins, and performing structural or enzymological characterizations.

2. Biological Characteristics

• Vector Type: Bacterial Expression Vector

• Expression Host: E. coli strains (e.g., BL21(DE3), DH5alpha, JM109)

• Bacterial Selection: Ampicillin (100 ug/mL) or Kanamycin (50 ug/mL)

• Key Functional Components:

  • Inducible Promoter: Strong inducible promoter system (e.g., lac, tac, or T7) regulated by IPTG

  • Ribosome Binding Site (RBS): Optimized Shine-Dalgarno sequence for precise translation initiation

  • Multiple Cloning Site (MCS): Multiple unique restriction sites for directional insert cloning

  • Affinity Tags: N- or C-terminal tags (e.g., 6xHis) for streamlined protein purification

  • Terminator: T1T2 or T7 transcription terminator for stable transcript processing

  • Origin of Replication: High-copy pUC or pBR322 origin

• Applications: Overexpression of recombinant proteins, metabolic engineering, protein-protein interaction studies, and structural biology

3. Culture and Handling Protocols

Cloning and Vector Propagation

• Cloning Host: E. coli DH5alpha or TOP10

• Growth Medium: LB Broth / LB Agar supplemented with selection antibiotics (e.g., Ampicillin or Kanamycin)

• Transformation Protocol:

  1. Thaw DH5alpha competent cells on ice and add 1 uL (10-50 ng) of plasmid DNA.

  2. Incubate on ice for 30 minutes, heat-shock at 42 degrees Celsius for 45 seconds, and place back on ice for 2 minutes.

  3. Add 500 uL of antibiotic-free LB broth and outgrow at 37 degrees Celsius for 1 hour.

  4. Spread onto selective LB agar plates and incubate overnight at 37 degrees Celsius.

Recombinant Protein Expression

• Expression Host: E. coli BL21(DE3)

• Induction Protocol:

  1. Transform plasmid into BL21(DE3) host, pick a single colony, and grow an overnight starter culture.

  2. Inoculate 1:100 into fresh selective LB broth and incubate at 37 degrees Celsius until OD600 reaches 0.6 to 0.8.

  3. Induce with 0.2 to 1.0 mM IPTG at 37 degrees Celsius for 3 to 4 hours (or at 16 to 25 degrees Celsius overnight for enhanced soluble expression).

  4. Harvest cells by centrifugation and purify the target protein using standard affinity chromatography (e.g., Ni-NTA).

4. Technical Data Summary

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