BioVector® pKCCpf1 CRISPR-Cas12a 细菌基因组编辑质粒 / pKCCpf1 CRISPR-Cas12a Bacterial Genome Editing Vector

一、 背景与来源说明 / Background & Origin

pKCCpf1 是一种用于原核生物/细菌（特别是在梭菌属 Clostridium 等革兰氏阳性菌或特定细菌宿主）中高效基因组编辑的 CRISPR-Cpf1（FnCpf1 / AsCpf1，即 Cas12a）表达质粒系统。该载体整合了 Cpf1 内切酶表达框与特定 crRNA（gDNA）克隆位点，结合重组或同源重组修饰模板（Donor DNA），可实现高精准度的靶向基因敲除、点突变或片段插入。与传统 Cas9 相比，Cpf1 识别富含 T 的 TTTN PAM 序列，并产生粘性末端（5' 突出端），在特定高 AT 含量菌株的基因工程中具备显著优势。

二、 质粒主要结构元件 / Key Vector Elements

• 质粒类型 / Vector Type：CRISPR-Cpf1 细菌基因组编辑质粒（Bacterial Genome Editing Vector）

• 核心效应蛋白 / Cas Protein：FnCpf1（来自于 Francisella novicida）或 AsCpf1，由适合细菌表达的启动子驱动

• PAM 识别位点 / PAM Sequence：5'-TTTN-3'（适合高 AT 含量的基因组靶向）

• crRNA 克隆位点 / crRNA Cloning Site：包含 BsaI 或 Type IIS 限制性内切酶位点，便于接头退火快速插入 spacer

• 筛选标记 / Selection Markers：

  • 细菌筛选（E. coli / Target Host）：Spectinomycin（壮观霉素）或 Chloramphenicol（氯霉素）

• 复制起点 / Origins of Replication：包含 E. coli 复制起点（pUC ori / pMB1）及宿主穿梭复制起点

三、 实验应用与构建流程 / Editing Workflow

1. Spacer 设计与克隆：针对靶基因编码区设计 20–24 bp 的 spacer，合成互补寡核苷酸链，退火后通过 Type IIS 酶切/连接直接重组进 pKCCpf1 的 crRNA 表达盒。

2. 修饰模板（Donor Template）整合：若进行精确敲除或点突变，将上游与下游同源臂（~500–1000 bp）克隆至质粒的多克隆位点（MCS）中。

3. 转化与表达诱导：电转化导入目标宿主菌，利用对应抗生素筛选重组阳性克隆，并在特定诱导剂作用下表达 Cpf1 进行基因切割与切割修复。

四、 技术指标简表 / Technical Data Summary

BioVector® pKCCpf1 CRISPR-Cas12a Bacterial Genome Editing Vector (English)

1. Background & Context

The pKCCpf1 vector is a CRISPR-Cpf1 (Cas12a)-based plasmid tailored for bacterial genome engineering, particularly in high-AT organisms such as Clostridium species or recalcitrant bacterial hosts. Utilizing Cpf1's unique features—a T-rich PAM requirement (5'-TTTN-3') and staggered 5' sticky-end DNA cleavage—pKCCpf1 facilitates high-efficiency gene knockouts, site-specific insertions, and point mutations.

2. Vector Elements & Architecture

• Vector Type: Bacterial CRISPR-Cas12a editing tool.

• Effector Protein: FnCpf1 / AsCpf1 driven by a inducible/constitutive promoter.

• crRNA Expression: Type IIS restriction-based (e.g., BsaI) golden-gate cloning region for spacer insertion.

• Selectable Marker: Spectinomycin / Chloramphenicol resistance.

3. Technical Data Summary

BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

电话:400-800-2947

工作QQ/微信同号:1843439339

E-mail:BioVector@163.com

网址http://www.biovector.net