Agrobacterium tumefaciens A136(pCF218/pCF372) BioVector®根癌农杆菌报告菌株AHL Reporter Strain

BioVector® Agrobacterium tumefaciens A136(pCF218/pCF372) 根癌农杆菌报告菌株 / BioVector® Agrobacterium tumefaciens Strain A136(pCF218/pCF372) AHL Reporter Strain

1 菌株基本信息与生理表型 / Bacterial Strain Identification and Phenotypic Profiling

• 菌株全称 (Full Strain Name)：BioVector® Agrobacterium tumefaciens Strain A136(pCF218/pCF372) 双质粒报告系统菌株。

• 常用别名与通用代号 (Synonyms & Line Designations)：

  • A. tumefaciens A136 Bio-reporter

  • A136(pCF218/pCF372) N-acyl homoserine lactone (AHL) Sensor Strain

  • BioVector® A136 Quorum Sensing Reporter System

• 宿主背景与质粒构建 (Host Genotype & Plasmids)：

  • 宿主菌株 A136：来源于 Agrobacterium tumefaciens C58 的无 Ti 质粒（Ti-plasmid cured）无致瘤性衍生株。

  • 质粒 pCF218：携带 traR 调控基因及四环素抗性标签（Tetracycline resistant, TcR）。

  • 质粒 pCF372：携带 traI-lacZ 融合报告基因及壮观霉素/链霉素抗性标签（Spectinomycin/Streptomycin resistant, SpR/SmR）。

• 形态与生长表型 (Morphology & Growth Profile)：革兰氏阴性杆菌（Gram-negative rod）。在含双抗的 LB 或 YEP 固体平板上呈现光滑、湿润、凸起的乳白色或淡黄色菌落，适宜生长倍增时间约为 2.5–3.5 小时。

Agrobacterium tumefaciens Colony Morphology. Source: Satirus / Getty Images

• 生物安全等级 (Biosafety Level)：1 级安全控制（BSL-1，群体感应/AHL 分子高灵敏度检测、菌群信号通讯及抗 Quorum Sensing 抑制剂筛选专用）。

2 分子信号机制与群体感应（QS）检测原理 / Quorum Sensing Sensing Mechanism and Bio-Assay Value

BioVector® A136(pCF218/pCF372) 是微生物群体感应研究领域公认的“长链及中链 AHL（N-酰基高丝氨酸内酯）信号分子高灵敏度生物传感器（Bio-reporter）”：The BioVector® A136(pCF218/pCF372) system is an ultra-sensitive bio-reporter platform designed for detecting long-chain and short/medium-chain N-acyl homoserine lactones (AHLs) via TraR-mediated β-galactosidase induction:

TraR-traI-lacZ 级联信号表达通路 (Signal Cascade Architecture)

• 检测机制 (Detection Mechanism)：外源 AHL 信号分子扩散入细胞后，与 pCF218 表达的 TraR 蛋白特异性结合并形成 TraR-AHL 复合物；该复合物激活 pCF372 上的 traI-lacZ 启动子，驱动 β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）高水平表达。

• 显色与检测模式 (Assay Readouts)：加入底物 X-gal 后显蓝色（定性/TLCA 板层析显色），或加入 ONPG 进行比色测定（定量），对 C6 至 C14 长度的 3-oxo-AHL 及未取代 AHL 分子展现极高灵敏度。(Responds to exogenous AHL quorum-sensing signals by inducing β-galactosidase, turning blue in the presence of X-gal for qualitative and quantitative detection.)

3 菌株完全培养基配方与双抗选育培养规范 / Culture Formulations and Antibiotic Selection

核心红线规程 / Mandatory Dual Antibiotics & Temperature NoticeA136(pCF218/pCF372) 属于双质粒保藏菌株，培养过程必须维持双抗选择压力。日常培养基中必须同时添加 Tetracycline（四环素）与 Spectinomycin（壮观霉素）；培养温度必须严格控制在 28-30 摄氏度，严禁超过 32 摄氏度（高温会导致 TraR 活性丧失或质粒丢失）。(Maintain strict dual-antibiotic selection with Tetracycline and Spectinomycin at 28–30 °C; temperatures above 32 °C induce plasmid instability.)

基础与完全培养基组分配方 / Complete Media Formulations

• 1. 高品质液体完全培养基 (BioVector® Complete Medium for A136 Bio-reporter)：

  • BioVector® LB / YEP Base Broth（LB 或 YEP 基础肉汤）：99%

  • BioVector® Tetracycline Stock Solution（四环素，终浓度 $4.5\text{–}10\mu \text{g/mL}$）

  • BioVector® Spectinomycin Stock Solution（壮观霉素，终浓度 $50\text{–}100\mu \text{g/mL}$）

• 2. 辅助显色与筛选平板 (Solid Assay Plates)：

  • BioVector® Solid LB/YEP Agar Plate with Dual Antibiotics + X-gal ($40\mu \text{g/mL}$)

标准物理培养环境 (Incubation Parameters)

• 气体与温度控制 (Incubation Setup)：摇床震荡培养（200-220 rpm），运行工作温度精密锁定在 28 摄氏度。

4 冻存菌种复苏、摇菌扩增与超低温保藏工作流 / Preservation and Assay Workflow

A 阶段：甘油菌的无菌划线复苏 / Phase A: Recovery from Cryovial

1. 从零下 80 摄氏度冰箱移出 BioVector® A136(pCF218/pCF372) 甘油冻存管，在冰上稍许解冻。

2. 使用无菌接种环挑取少许菌液，划线接种至含 Tetracycline + Spectinomycin 的 LB/YEP 固体平板上。

3. 置于 28 摄氏度恒温培养箱 中倒置培养 36-48 小时，待长出单菌落。

B 阶段：液体摇菌与报告检测准备 / Phase B: Liquid Culture & Reporter Prep

1. 挑取单菌落接种至 5 mL 含双抗的 BioVector® Complete Medium 中。

2. 28 摄氏度、200 rpm 摇动培养过夜（16-18 小时）至对数末期。

3. 按实验需求稀释菌液，加入样品及底物（X-gal / ONPG）进行 AHL 显色或吸光度测定。

C 阶段：甘油冻存菌种保藏 / Phase C: Glycerol Stock Preparation

1. 取处于对数生长期（${\text{OD}}_{600}\approx 0.8\text{–}1.0$）的菌液。

2. 按 1:1 体积比与 BioVector® 30% 无菌甘油保藏液 混合均匀（终甘油浓度 15%）。

3. 分装至无菌冻存管中，直接置于 零下 80 摄氏度 超低温冰箱长期保存。

5 质粒丢失防范与 β-半乳糖苷酶背景表达一票否决制质控红线 / Downstream Quality Control Metrics

双质粒维持与质粒 PCR/抗性常规筛查 (Plasmid Retention Surveillance)

由于该菌株同时携带 pCF218 与 pCF372 两个不同抗性标记的质粒，必须定期使用 BioVector® Plasmid Isolation & PCR Kit 验证 traR 及 lacZ 载体片段；同时定期在单抗/无抗平板上比对生长情况，确保质粒无丢失。

无 AHL 诱导下漏底表达（Background β-gal $\le 5\%$）一票否决制质控红线 (Reporter Integrity Gatekeeper)

为了阻断由于质粒突变、启动子构成型表达、或培养基被外源 AHL 污染导致高背景假阳性的灾难性后果，质控部门或研究人员必须在菌株建库与检测前，执行硬性的“漏底表达 Identity”一票否决制质控：

1. 双抗筛选红线：菌株在含四环素+壮观霉素的平板上必须 100% 正常生长，在无抗/单抗平板上表现为特定选择压依赖。

2. 阴性对照背景色质控红线（核心考核）：在无外源 AHL 信号分子添加的 X-gal 平板或 ONPG 反应体系中，$\beta$-半乳糖苷酶漏底表达活性（显色反应）必须严格小于或等于阳性对照峰值的 $5.0\%$（平板呈现纯白色菌落）。

3. 一票否决处理规范：一旦质控检测发现未添加 AHL 即出现明显的自发变蓝（漏底 $\ge 5\%$），或双抗平板下无法生长/质粒丢失，该批次菌株执行一票否决红线制，全盘作废彻底高压灭菌销毁（121 摄氏度，20 分钟）。绝对禁止将高背景/失活菌株投入检测。必须立刻重新复苏原始极低代次的 BioVector® A136(pCF218/pCF372) 种子甘油管，重新开启扩增与质控循环。(Enforce a rigid functional gatekeeper: A136(pCF218/pCF372) reporter stocks must strictly retain dual-plasmid antibiotic resistance paired with $\le 5.0\%$ background β-galactosidase leakage without exogenous AHLs. Any high constitutive expression or plasmid loss triggers an immediate system veto to destroy running cultures instantly.)