BioVector® DLD-1 BRCA2(-/-) 人结直肠腺癌基因敲除细胞株 / BioVector® Human Colorectal Adenocarcinoma DLD-1 BRCA2 Deficient Knockout Cell Line

1 细胞株基本信息与生理表型 / Cell Line Identification and Physiological Profiling

• 细胞株名称 (Cell Line Name)：BioVector® DLD-1 BRCA2(-/-) 人结直肠腺癌基因敲除细胞株 (BioVector® Human Colorectal Adenocarcinoma DLD-1 BRCA2 Knockout Isogenic Cell Line)。

• 常用别名与通用代号 (Synonyms & Alternative Line Designations)：

  • DLD-1 BRCA2 Knockout (BRCA2KO)

  • DLD-1 BRCA2 Null Isogenic Pair

  • BioVector® DLD-1 BRCA2-/- Homozygous Mutant Strain

  • HD R02-012 / DLD1-BRCA2-KO Baseline

• 种属与组织来源 (Species & Tissue Origin)：人（Homo sapiens），来源于成年男性结直肠腺癌（Colorectal Adenocarcinoma）DLD-1 亲本细胞系通过基因靶向技术（TALEN / CRISPR-Cas9 或同源重组）敲除 BRCA2 外显子（Exon 11）构建的同基因型（Isogenic）纯合缺失株。

• 基因型与表型指纹 (Genotype & Phenotypic Fingerprint)：BRCA2 基因纯合失活，功能性 BRCA2 蛋白表达完全缺失；保持 DLD-1 亲本细胞系的 STR 基因型指纹（微卫星不稳定 MSM 型，含 KRAS G13D 突变、TP53 突变、PIK3CA 突变）。

• 形态与生长表型 (Morphology & Growth Profile)：上皮样细胞（Epithelial-like），贴壁生长（Adherent）。呈紧密贴壁的多角形岛状聚集分布，对 DNA 损伤剂（铂类药物及 PARP 抑制剂）表现出极高的高敏感性。


DLD-1 Epithelial Morphology Profiling. Source: Culture Collections

• 生物安全等级 (Biosafety Level)：1 级安全控制（BSL-1，体外科研与药物筛选专用）。

2 分子肿瘤学特征与合成致死/PARP抑制剂筛选模型价值 / Molecular Dynamics and Synthetic Lethality Models

BioVector® DLD-1 BRCA2(-/-) 细胞株及其配套的亲本 DLD-1 BRCA2(+/+) 细胞系是评估同源重组缺陷（HRD）、合成致死（Synthetic Lethality）效应、PARP 抑制剂（如 Olaparib, Rucaparib, Niraparib）抗肿瘤活性评估以及 DNA 损伤修复（DDR）通路机制研究中公认的“国际标准同基因靶向对照基准”：The BioVector® DLD-1 BRCA2(-/-) cell line serves as the premiere isogenic knockout model for studying homologous recombination deficiency (HRD), synthetic lethality screens, PARP inhibitor response, and double-strand break repair mechanisms:

核心 BRCA2 缺失表型与合成致死敏感性 (BRCA2 Deficient Phenotype & Synthetic Lethality)

作为缺失 DNA 双链断裂同源重组修复（HRR）核心蛋白的工程毒株，该细胞在分子功能层面展现出确凿的药物高敏感指纹：

• 同源重组修复缺陷 (HRD Molecular Signature)：由于缺失 BRCA2 蛋白介导的 RAD51 丝状体装配能力，细胞无法通过高保真的 HR 通路修复 DNA 双链断裂（DSB），转向高度易错的非同源末端连接（NHEJ）或微同源末端重排（MALT）。

• PARP1 抑制剂极端敏感性 (Synthetic Lethal Sensitivity)：在存在 PARP 抑制剂的情况下，细胞内单链断裂（SSB）无法修复并在复制叉处积累转化为致命的双链断裂，导致该敲除细胞株发生特异性凋亡，而亲本 BRCA2(+/+) 细胞则不受明显影响。(Provides a rigorous homologous recombination deficient (HRD) system with extreme sensitivity to PARP inhibitors and platinum agents compared to its isogenic BRCA2+/+ counterpart.)

3 细胞完全培养基配方与无血清传代栽培规范 / Routine Culture and Maintenance Formulations

核心红线规程 / Seed Density & Complete Adhesion NoticeDLD-1 BRCA2(-/-) 细胞相比于野生型亲本株生长稍缓（代时延长至约 28-32 小时），对消化过度极度敏感，且非常依赖细胞间的接触通讯。日常传代接种密度必须维持在 $2\times 10^4{\text{cells/cm}}^2$ 以上，绝对禁止进行超高倍数稀释传代（如 1:20 稀释，极易引发细胞大面积单克隆凋亡）。消化必须使用温和的 BioVector® Trypsin-EDTA Digest Solutions，并在显微镜下严格监控细胞收缩撤退，一经脱落立刻加入含血清培养基终止消化。(Cultivate strictly at optimal densities ($\ge 2\times 10^4{\text{cells/cm}}^2$) using specialized BioVector® RPMI-1640 media; avoid harsh trypsinization to maintain cell viability and line integrity.)

基础与完全培养基组分配方 / Complete Growth Media Formulations

• 1. 高品质完全培养基 (BioVector® Complete RPMI-1640 Medium for DLD-1)：

  • BioVector® Advanced RPMI-1640 Medium Base（高糖 RPMI-1640 基础）：89%

  • BioVector® Ultra-Clean Fetal Bovine Serum（超净胎牛血清，经热灭活）：10%

  • BioVector® Certified Penicillin-Streptomycin（优质双抗补剂）：1%

• 2. 辅助细胞消化与洗涤液 (Cell Harvest Reagents)：

  • BioVector® Gentle Trypsin-EDTA Digest Solution（温和胰酶消化液，0.25% Trypsin + 0.02% EDTA）

  • BioVector® Sterile Phosphate Buffered Saline（无菌 PBS 洗涤液）

标准物理培养环境 (Incubation Parameters)

• 气体与温度控制 (Incubation Setup)：标准恒温加湿培养箱，运行工作温度精密锁定在 37 摄氏度，5% 二氧化碳 (${\text{CO}}_2$)。

4 细胞冻存管复苏、传代培养与超低温冻存工作流 / Thawing, Passage, and Cryopreservation Workflows

A 阶段：细胞冻存管的快速复苏启动 / Phase A: Thawing & Primary Seeding

1. 从零下 196 摄氏度液氮罐或超低温冰箱中移出 BioVector® DLD-1 BRCA2(-/-) 细胞冻存管，立刻放入 37 摄氏度水浴 中快速摇晃融化（2 分钟内）。

2. 在无菌超净台内，将融化的细胞悬液转移至含 5 mL 预热 BioVector® Complete RPMI-1640 Medium 的 15 mL 离心管中。

3. 1,000 rpm（约 $200\times g$）离心 5 分钟，弃去含 DMSO 的冻存上清。

4. 加入 5 mL 新鲜完全培养基重悬细胞，接种至 T25 培养瓶中，放入 37 摄氏度、5% CO2 孵箱中培养过夜。

B 阶段：日常传代与消化操作 / Phase B: Subculturing Protocol

1. 当细胞融合度达到 70%-80% 时进行传代（切勿让细胞生长至 100% 过饱和）。

2. 吸弃旧培养基，用 BioVector® PBS 洗涤液 轻柔清洗细胞层 1-2 次。

3. 加入 1 mL BioVector® Gentle Trypsin-EDTA，置于 37 摄氏度孵箱温育 2-3 分钟，显微镜下观察至细胞变圆脱落。

4. 立即加入 3 mL 预热的完全培养基终止消化，轻柔吹打制成单细胞悬液。

5. 按 1:3 至 1:5 的比例（密度不低于 $2\times 10^4{\text{cells/cm}}^2$）转接至新的培养瓶中，补足完全培养基继续培养。

C 阶段：高存活率超低温冻存建立 / Phase C: Cryopreservation

1. 收集处于对数生长盛期（融合度约 80%）的 DLD-1 BRCA2(-/-) 细胞。

2. 使用 BioVector® Serum-Free Cell Cryopreservation Medium（无血清高效细胞冻存液） 重悬细胞，调整细胞密度至 $1\times 10^6\text{–}3\times 10^6\text{cells/mL}$。

3. 分装至无菌冻存管中，使用程序降温盒置于零下 80 摄氏度冰箱过夜，随后转入 液氮罐（零下 196 摄氏度） 长期保存。

5 支原体/STR鉴定与 Western Blot 蛋白质缺失及 PARP 抑制剂高敏感（IC50 差异 $\ge 100$ 倍）一票否决制质控红线 / Downstream Quality Control Metrics

支原体与 STR 基因同源性常规筛查 (Contamination & Lineage Identity Surveillance)

DLD-1 BRCA2(-/-) 极易因交叉污染导致杂株混入或发生野生型回复突变。必须定期使用 BioVector® Mycoplasma PCR Detection Kit 筛查支原体；同时，定期使用 BioVector® Human STR Profiling Kit 验证 18 个 STR 位点（必须与 DLD-1 亲本系同源度 $\ge 98\%$）。

Western Blot 蛋白缺失与 PARP 抑制剂高敏（${\text{IC}}_{50}\le 1/100$ 亲本株）一票否决制双质控红线 (Functional Defect Gatekeeper)

为了阻断由于基因回复突变、克隆漂移、支原体隐性污染致使合成致死药物筛选实验彻底失效或产生假阴性/假阳性结果的灾难性后果，质控部门或研究人员必须在细胞扩增与建库前，执行硬性的“蛋白表达-药物敏感”双重一票否决制质控：

1. Western Blot 蛋白表达质控红线：使用抗 BRCA2 单克隆抗体进行 Western Blot 检测，DLD-1 BRCA2(-/-) 细胞必须完全无 BRCA2 全长蛋白（约 384 kDa）条带显色（缺失率 100%），绝对不能出现任何微弱表达或截短恢复条带。

2. Olaparib PARP 抑制剂敏感性质控红线（核心考核）：取 DLD-1 BRCA2(-/-) 细胞与 DLD-1 BRCA2(+/+) 亲本细胞，平行进行 Olaparib（奥拉帕利）72 小时 CCK-8 细胞毒性检测。BRCA2 敲除株的 IC${50}$ 值必须严格达到亲本株的 1/100 以下（即敏感性增高至少 100 倍，通常敲除株 IC${50} \le 100\text{ nM}$，而野生型亲本株 $\ge 10\mu \text{M}$）。

3. 一票否决处理规范：一旦质控检测发现 BRCA2 蛋白回复表达，或 PARP 抑制剂敏感性差异跌破 100 倍门槛线（或检测出支原体阳性），该生产或实验批次细胞执行一票否决红线制，全盘作废彻底高压灭菌销毁（121 摄氏度，20 分钟）。绝对禁止将恢复 HR 功能或表达漂移的细胞投入下游合成致死或抗肿瘤药物筛选。必须立刻重新复苏原始低代次的 BioVector® DLD-1 BRCA2(-/-) 种子细胞管重新开启扩增与质控循环。(Enforce a rigid, non-negotiable functional gatekeeper: DLD-1 BRCA2(-/-) cell stocks must strictly verify 100% absence of full-length BRCA2 protein via Western Blot alongside a $\ge 100$-fold IC$_{50}$ hypersensitivity shift to Olaparib over the wild-type parental line. Any dynamic expression reversion or loss in synthetic lethality sensitivity triggers an immediate system veto to destroy running cultures instantly.)