BioVector® RMA-S 小鼠淋巴瘤 TAP 缺陷型永生化标准细胞株 / BioVector® RMA-S Mouse Lymphoma TAP-Deficient Standard Reference Cell Line

1 细胞基本信息与悬浮表型 / Cell Identification and Morphological Profiling

• 细胞名称 (Cell Name)：BioVector® RMA-S 小鼠淋巴瘤 TAP 缺陷型永生化标准细胞株 (BioVector® RMA-S Mouse Lymphoma TAP-Deficient Standard Reference Cell Line)

• 种属与单倍型 (Species & H-2 Haplotype)：小鼠（Mus musculus，C57BL/6 背景，MHC 单倍型为 $\text{H-2}^b$）。

• 组织来源 (Tissue Origin)：来源于 C57BL/6 小鼠的 T 淋巴瘤细胞系 RMA（Rauscher 病毒诱导的 T 细胞淋巴瘤），经体外诱变筛选得到的 TAP2（Transporter Associated with Antigen Processing 2）基因功能缺陷型衍生突变株。

• 生长特性 (Growth Properties)：悬浮生长（Suspension Growth）。

• 细胞形态 (Cell Morphology)：典型的淋巴母细胞样（Lymphoblast-like）形态。呈规则的圆球形，悬浮于培养液中，单个分散或呈小簇状聚集。胞体较小，核大而圆，胞质相对较少。(Displays classic spherical lymphoblastoid morphology in suspension, growing as individual round cells or loose clusters.)

• 安全等级 (Biosafety Level)：1 级安全控制（BSL-1，体外科研专用，严禁用于人体体内接种或临床诊疗）。

2 分子细胞生物学特征与 TAP 缺陷及外源肽结合模型价值 / Molecular Dynamics and MHC Class I Peptide Loading Models

BioVector® RMA-S 细胞株是现代肿瘤免疫学、NK 细胞识别机制、MHC I 类分子重组与表位肽（Peptide-Binding Assay）亲和力筛选中不可替代的国际标准模式材料：

The BioVector® RMA-S line embodies a classic TAP2 deficiency that impairs endogenous peptide transport, resulting in unstable, empty surface MHC class I ($\text{H-2K}^b / \text{H-2D}^b$) molecules that stabilize upon exogenous peptide binding or lower temperature incubation ($26\text{--}31^\circ\text{C}$):

TAP2 缺陷机制与温敏性 $\text{H-2}^b$ 表达特征红线 (TAP Deficiency & Thermolabile Surface Expression)

作为全球免疫学界最广泛使用的抗原提呈缺陷模型之一，该细胞株在基因表达与细胞表面分子装配上锁定了极其严苛的指纹：

• TAP 复合体功能缺失 (TAP2 Defect)：由于内源性 TAP2 蛋白缺失，细胞质中的内源性抗原肽无法转运入内质网网腔，导致 MHC I 类分子重链（$\text{H-2K}^b / \text{H-2D}^b$）与 $\beta_2$-微球蛋白（$\beta_2\text{m}$）无法获得肽段稳定结合。

• 温敏性表面装配与外源肽救救援 (Temperature Sensitivity & Peptide Rescue)：在常规 $37^\circ\text{C}$ 培养下，细胞表面只有极低水平的空载 MHC I 类分子（极易降解）；当切换至 $26^\circ\text{C} \text{--} 31^\circ\text{C}$ 低温培养 或在培养基中加入外源性 $\text{H-2}^b$ 特异性结合肽时，表面 $\text{H-2K}^b / \text{H-2D}^b$ 的表达量会发生数十倍的剧烈上调。这一特征使其成为鉴定 CTL 表位肽亲和力的“金标准”工具。(Features a rigid TAP2 deficiency that limits endogenous MHC class I peptide loading, serving as an irreplaceable platform for exogenous peptide binding and NK cell cytotoxicity assays.)

3 细胞完全培养基配方与低温/外源肽诱导栽培规范 / Routine Culturing and Nutritional Formulations

核心红线规程 / Overgrowth and Temperature Shift Warning

RMA-S 为高代谢率的悬浮淋巴瘤细胞，对细胞密度和培养基 $\text{pH}$ 值极其敏感。日常维持培养时，密度必须严格控制在 $1 \times 10^5 \text{至} 1 \times 10^6 \text{ cells/mL}$ 范围内。绝对禁止让细胞过度生长至培养液发黄变酸（> $2 \times 10^6 \text{ cells/mL}$），否则会导致细胞大量碎片化并发生不可逆的表型退化。若用于外源肽加载或 MHC I 类分子上调实验，需提前将细胞置于 BioVector® 专用低温 Incubator（$26^\circ\text{C} \text{--} 31^\circ\text{C}$）中孵育过夜。(极易因密过大过酸导致衰退。Keep cell density strictly within $1 \times 10^5 \text{--} 1 \times 10^6 \text{ cells/mL}$ using BioVector® standard RPMI-1640 formulations.)

基础与完全培养基组分配方 / Complete Culture Media Formulations

• 常规悬浮完全培养基 (Complete Growth Medium)：

  • BioVector® Premium RPMI-1640 Base Medium（优质 RPMI-1640 基础培养基）：89%

  • BioVector® High-Purity Fetal Bovine Serum（高纯灭活胎牛血清）：10%

  • BioVector® 2-Mercaptoethanol Supplement（$\beta$-岢基乙醇补剂）：终浓度 $0.05\,\text{mM}$（维持淋巴细胞还原环境的核心补剂）

  • BioVector® Certified Penicillin-Streptomycin（优质双抗补剂）：1%

标准物理培养环境 (Incubation Parameters)

• 气体与温度控制 (Incubation Setup)：

  • 日常增殖培养：标准恒温加湿细胞孵箱，运行工作温度精密锁定在 37 摄氏度，连续稳定通入 5% 二氧化碳 ($\text{CO}_2$)。

  • MHC I 类分子表面稳定诱导（实验组）：移入低恒温孵箱，工作温度锁定在 26 至 31 摄氏度（推荐 26 摄氏度），孵育 12 至 18 小时。

4 细胞冻存管复苏、悬浮半换代传代与冷冻保藏工作流 / Thawing, Passage, and Cryopreservation Workflows

A 阶段：冻存管解冻与复苏启动 / Phase A: Cell Thawing and Recovery

1. 从液氮罐或零下 80 摄氏度冰箱中取出 BioVector® RMA-S 细胞冻存管，立刻完全浸没在 37 摄氏度恒温水浴锅中高频快速晃动，在 1 分钟内使其冰晶瞬间融化。

2. 在超净台内，将融化的细胞悬液缓慢注入含有 5 mL 预热 BioVector® RPMI-1640 完全培养基的 15 mL 无菌离心管中。

3. 以 200 乘以 g 离心 5 分钟，弃去含 DMSO 的上清液。

4. 使用 5 mL 预热完全培养基重悬细胞沉淀，接种至 T25 培养瓶中，置于 37 摄氏度、5% $\text{CO}_2$ 孵箱中静置培养。

B 阶段：日常悬浮传代与密度控制（半换液/稀释法） / Phase B: Subculturing Method

1. 每日观察细胞密度与澄清度。当细胞密度达到约 $8 \times 10^5 \text{ cells/mL}$ 时启动传代（通常每 2 至 3 天传代一次）。

2. 传代操作：悬浮细胞无需胰酶消化。轻柔吹打培养瓶使细胞分布均匀，吸出 $2/3 \text{至} 3/4$ 的细胞悬液。

3. 补入等体积新鲜的 BioVector® RPMI-1640 完全培养基，调整起始密度锁定在 $1 \text{至} 2 \times 10^5 \text{ cells/mL}$ 即可。

C 阶段：高品质主细胞库甘油/DMSO 冻存保藏建立 / Phase C: Cryopreservation Workflow

1. 收集处于对数生长期（活性 $> 95\%$、密度约 $5 \text{--} 8 \times 10^5 \text{ cells/mL}$）的 RMA-S 悬浮细胞。

2. 以 200 乘以 g 离心 5 分钟 收集细胞沉淀。

3. 使用预冷的 BioVector® Cell Cryopreservation Medium（含 90% 胎牛血清 + 10% DMSO） 重悬细胞，使最终细胞密度达到 $5 \times 10^6 \text{ cells/mL}$。

4. 分装至无菌冻存管中，放入程序降温盒内，置于零下 80 摄氏度冰箱过夜，24 小时内转移至液氮罐（零下 196 摄氏度）气相层中进行长期保藏。

5 支原体监控与低温诱导 $\text{H-2K}^b$ 上调（$\ge 10$ 倍）一票否决制质控红线 / Downstream Quality Control Metrics

支原体隐性污染常规筛查 (Mycoplasma Surveillance)

悬浮淋巴瘤细胞对支原体（Mycoplasma）污染高度敏感，隐性污染会导致细胞表面蛋白表达失调及免疫功能测定异常。必须每 4 周对细胞上清进行支原体 PCR 筛查。

使用 BioVector® Mycoplasma PCR Detection Kit（支原体高灵敏 PCR 检测试剂盒） 扩增上清。一旦电泳检测出现阳性污染条带，必须立即执行红线熔断消杀：彻底将该污染批次的细胞悬液高压灭菌（121 摄氏度，20 分钟），并对孵箱等全部空间使用 BioVector® Mycoplasma Disinfectant Spray（支原体专用高效消杀喷剂） 进行饱和喷洒消杀。(Any trace contamination commands an immediate red-line system shutdown: cancel active lines via autoclave at 121 degrees Celsius.)

低温（$26^\circ\text{C}$）诱导 $\text{H-2K}^b$ 表达上调幅度（$\ge 10.00$ 倍）一票否决制质控红线 (TAP-Deficiency Functionality Validation Metric)

为了阻断由于长期传代导致 RMA-S 细胞发生回复突变（Reversion）、表达恢复正常 TAP 功能，或防范细胞被父本 RMA 细胞系隐性顶替混淆，质控部门或研究人员必须在细胞株连续传代每超过 10 代时，提取活细胞执行硬性的 TAP 缺陷功能一票否决制质控：

1. 温敏性 $\text{H-2K}^b$ 表达质控红线：将活细胞分为两组，一组置于 $37^\circ\text{C}$ 培养 18 小时，另一组置于 $26^\circ\text{C}$ 培养 18 小时。随后使用 FITC 标记的抗小鼠 $\text{H-2K}^b$ 单克隆抗体进行流式细胞术（FACS）测定。

2. 质控底线门槛：$26^\circ\text{C}$ 低温培养组细胞表面的 $\text{H-2K}^b$ 平均荧光强度（MFI）必须达到 $37^\circ\text{C}$ 培养组的 $\ge 10.00$ 倍（即展现出极其显著的低温救救援效应）。

3. 一票否决处理规范：一旦质控检测发现 $26^\circ\text{C}$ 诱导后的 $\text{H-2K}^b$ 上调幅度跌破 $10.00$ 倍门槛线（表明发生 TAP 功能回复或被杂菌/野生型细胞顶替），该生产或实验批次细胞执行一票否决红线制，全盘作废彻底灭菌销毁。绝对禁止向外交付该批次功能异常细胞或将其投入后续任何表位肽结合与 NK 杀伤实验。必须立刻重新复苏 pristine 原始极低代次的 BioVector® RMA-S 种子冷冻管重新开启扩增与质控循环。(Enforce a rigid, non-negotiable functional gatekeeper: the mean fluorescence intensity (MFI) of surface $\text{H-2K}^b$ expression under $26^\circ\text{C}$ incubation must exhibit a $\ge 10.00$-fold increase compared to that at $37^\circ\text{C}$. Any dynamic fall below this 10-fold induction threshold triggers an immediate system veto to destroy running cultures instantly.)

BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

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