BioVector® AR-EcoScreen 人雄激素受体转录激活报告基因细胞株 / BioVector® AR-EcoScreen Human Androgen Receptor Transcriptional Activation Reporter Cell Line

1 细胞基本信息与培养表型 / Cell Identification and Morphological Profiling

• 细胞名称 (Cell Name)：BioVector® AR-EcoScreen 人雄激素受体转录激活报告基因永生化细胞株 (BioVector® AR-EcoScreen Human Androgen Receptor Transcriptional Activation Reporter Cell Line)

• 组织来源 (Tissue Origin)：以人类前列腺癌细胞株（Chinese Hamster Ovary, CHO-K1 衍生宿主体系）为底物，通过稳定转染全长人源雄激素受体基因（Human Androgen Receptor, hAR）以及由雄激素响应元件（ARE）驱动的萤火虫萤光素酶（Firefly Luciferase, luc）报告基因表达质粒构建而成。该株系为经济合作与发展组织（OECD 试验指南 No. 458）官方认可推荐的内分泌干扰物（EDCs）雄激素受体激动/拮抗活性高通量筛选标准工具。

• 生长特性 (Growth Properties)：贴壁生长 (Adherent)。

• 细胞形态 (Cell Morphology)：上皮样 (Epithelial-like)。细胞在贴壁状态下呈扁平多角形或短梭形，胞质透明，单层铺路石状均匀排布。在低密度下散在生长，在汇合度高时细胞间紧密衔接，呈现极其规则的单层结构。(Displays consistent, uniform epithelial-like flat polygonal morphology, forming tightly packed monolayers with stable attachment properties.)

• 安全等级 (Biosafety Level)：1 级安全控制（BSL-1，体外科研与毒理学替代实验专用，严禁用于人体体内直接接种、医疗或临床诊断）。

2 分子细胞生物学特征与 OECD 内分泌干扰物检测模型价值 / Molecular Dynamics and High-Throughput EDCs Screening Models

BioVector® AR-EcoScreen 细胞株是现代环境毒理学、抗前列腺癌药物（抗雄激素小分子）高通量筛选以及化学品内分泌干扰风险评估（OECD TG 458）中不可替代的国际标准化重组报告基因细胞模型：

The BioVector® AR-EcoScreen stable reporter platform provides a validated, standardized mechanism for detecting human androgen receptor activation or inhibition in compliance with global regulatory guidelines (OECD TG 458):

双质粒共表达转录激活级联红线 (Dual-Plasmid Transcriptional Activation System)

作为严格按照国际毒理学监管标准构建的工程细胞模型，该株系在基因组内锁定了极其严苛的表达平衡红线：

• 人源 AR 与 ARE-Luciferase 稳定共整合 (Stable Dual-Vector Integration)：细胞染色体组内高拷贝且稳定整合了人源 hAR 结构基因与 $AR-responsive\ element (ARE)_4-luciferase$ 报告卡盒。当外源雄激素激动剂（如双氢睾酮 DHT）与胞质内的 hAR 结合后，受体发生构象改变并异位至细胞核，结合至 ARE 启动子区，强力诱导下游萤火虫萤光素酶蛋白的表达。

• 极高诱导倍数与高信噪比 (High Signal-to-Background Ratio)：在标准 10 nM DHT 刺激下，其荧光素酶发光信号值可达基线（无刺激对照）的数十至上百倍，并对经典抗雄激素药物（如氟他胺 Flutamide、比卡鲁胺 Bicalutamide）表现出高度剂量依赖性的竞争性抑制曲线。(Features stably integrated full-length human AR along with ARE-promoter driven luciferase cassettes, yielding high dynamic range bioluminescence responses upon hormonal stimulation.)

3 细胞完全培养基配方与防止酚红/外源激素干扰栽培规范 / Routine Culturing and Nutritional Formulations

核心红线规程 / Phenol Red and Exogenous Steroid Interference Warning

AR-EcoScreen 作为对极微量雄激素/抗雄激素物质极其敏感的报告基因细胞株，日常维持与实验测试具有完全不同的培养规范。常规维持培养时需添加加压选择性抗生素（G418 与 Hygromycin B）以防止报告基因质粒丢失；但在进入雄激素响应测试（Assay Mode）前 24-48 小时及测试期间，必须强制切换至“无酚红（Phenol Red-Free）”且使用“活性炭/脱脂剥离胎牛血清（Dextran-Stripped Charcoal-Treated FBS, DCC-FBS）”的专用测试培养基。常规培养基中的酚红具有弱雌/雄激素样活性，而普通血清中内源性内分泌激素会强行填满 hAR 结合位点导致本底信号暴顶、报告系统失灵彻底报废。(极易受酚红与常规血清内源激素干扰。Never use conventional serum or phenol-red media during activation assays; apply exclusively BioVector® DCC-stripped, phenol-red-free media grids to prevent background signal saturation.)

基础与完全培养基组分配方 / Complete Culture Media Formulation

• 常规维持完全培养基 (Maintenance Complete Medium)：

  • BioVector® Premium DMEM/F-12 Liquid Medium (含酚红常规基础培养基)：89%

  • BioVector® Certified Standard Fetal Bovine Serum（优质胎牛血清 / FBS）：10%

  • BioVector® Geneticin (G418 Selection Grade)（G418 加压筛选补剂）：终浓度 200 ug/mL（维持 hAR 质粒稳定）

  • BioVector® Hygromycin B Selection Supplement（潮霉素 B 筛选补剂）：终浓度 100 ug/mL（维持 ARE-Luc 质粒稳定）

  • BioVector® Certified Penicillin-Streptomycin（优质双抗补剂）：1%

• 测试专用无激素培养基 (Assay Testing Medium)：

  • BioVector® Phenol Red-Free DMEM/F-12 Base Medium（无酚红专用基础培养基）：94%

  • BioVector® Charcoal-Dextran Stripped FBS (DCC-FBS, 剥离激素高级血清)：5%

  • BioVector® Certified Penicillin-Streptomycin（优质双抗补剂）：1%（注：测试期间无需添加 G418 与潮霉素 B）

标准物理培养环境 (Incubation Parameters)

• 气体与温度控制 (Atmospheric Setup)：标准恒温加湿细胞孵箱，运行工作温度精密锁定在 37 摄氏度，连续稳定通入 5% 二氧化碳 ($\text{CO}_2$)，孵箱内环境相对湿度恒定维持在 95% 以上，彻底隔绝因液体蒸发导致的盐浓度失稳及背景信号漂移。

4 细胞冻存管复苏、连续传代与冷冻保存工作流 / Thawing, Passage, and Cryopreservation Workflows

A 阶段：低损失细胞库冻存管的解冻复苏启动 / Phase A: Cryovial Thawing

1. 从液氮罐气相层中小心移出 BioVector® AR-EcoScreen 细胞冻存管，立刻完全浸没在 37 摄氏度恒温水浴锅中高频快速晃动，在 1 分钟左右使其内部冰晶瞬间融化解冻。

2. 在生物安全柜内，将融化的细胞悬液缓慢注入含有 5 mL 预热 BioVector® 常规维持完全培养基（暂不加加压抗生素）的 15 mL 无菌离心管中，轻柔吹打混匀。

3. 以 1000 乘以 g 离心 4 分钟，彻底倒掉含有保藏加压物 DMSO 的旧上清液。

4. 加入 5 mL 新鲜维持完全培养基重悬细胞沉淀，接种至常规 T25 细胞培养瓶中。24 小时细胞完全贴壁后换液，并首次加入全量 G418 与潮霉素 B 选择性抗生素。

B 阶段：日常高活性报告基因细胞传代操作 / Phase B: Subculturing Method

1. 每 2-3 天观察一次。当细胞单层覆盖面积达到整个视角的 80% 至 90% 汇合度时，必须立即启动传代程序，严禁过夜过密长满。

2. 吸除旧维持完全培养基。使用无菌的 BioVector® PBS（不含钙镁洗涤液） 平稳润洗单层 1 次。

3. 向瓶内加入 1.0 mL BioVector® Trypsin-EDTA for Standard Lines（常规优质温和胰蛋白酶消化液）。置于 37 摄氏度孵箱中封闭消化 2 至 3 分钟。

4. 镜下终止红线：一旦镜下见多角形胞体回缩、细胞间隙变大、单层大面积滑动变圆时，立即注入双倍体积的含血清维持完全培养基终止消化。吹打成单细胞悬液，传代比例严格锁定在 1比3 到 1比6 之间。

C 阶段：高品质报告基因种子细胞冷冻保存建立 / Phase C: Safe Cryopreservation

1. 收集处于对数生长最旺盛、未发生报告质粒丢失、形态均一的低代次 AR-EcoScreen 细胞沉淀。

2. 配制高级细胞冻存基质液，推荐组分为：BioVector® DMEM/F-12 基础液（50%）+ BioVector® Certified FBS（40%）+ BioVector® Cryo-Grade DMSO（10%）；或直接选用一体化无菌安全型的 BioVector® Cellular Cryopreservation Medium 专用快速冻存液。

3. 调整细胞重悬密度至 3 乘以 10^6 到 5 乘以 10^6 个细胞/mL 之间，分装入微量无菌冻存管。

4. 将冻存管垂直放入 BioVector® Programmed Cooling Container（细胞程序降温盒） 中，立刻移入零下 80 摄氏度超低温冰箱中放置过夜。24 小时内必须将冻存管转移至液氮罐（零下 196 摄氏度）气相层中进行终极长期冷冻储存。

5 支原体监控与 10 nM DHT 诱导倍数 ($I_{max} \ge 15.0$) 报告系统功能一票否决制质控红线 / Downstream Quality Control Metrics

支原体隐性污染常规筛查 (Mycoplasma Surveillance)

AR-EcoScreen 细胞作为精确定量评估化合物雄激素活性（EC50/IC50）的报告基因载体，隐性支原体（Mycoplasma）的潜伏污染会通过直接破坏细胞膜受体转运机制及降解胞内 ATP，人为导致萤光素酶发光反应的底物催化效率暴跌，引发严重假阴性或假阳性毒理学结论。必须每 4 周对细胞进行支原体 PCR 筛查。

使用 BioVector® Mycoplasma PCR Detection Kit（支原体高灵敏 PCR 检测试剂盒） 扩增上清。一旦电泳检测在目标区间出现阳性污染条带，必须立即执行红线熔断消杀：彻底将该污染批次的细胞瓶高压灭菌（121 摄氏度），并对孵箱等全部空间使用 BioVector® Mycoplasma Disinfectant Spray（支原体专用高效消杀喷剂） 进行多轮饱和喷洒，随后重新复苏原始低代次种子细胞。(Any trace contamination resolved by the BioVector® Mycoplasma PCR Kit commands an immediate red-line system shutdown: cancel active lines via autoclave at 121 degrees Celsius and sanitize the environmental footprint via BioVector® Mycoplasma Disinfectant Spray.)

10 nM DHT 诱导倍数 ($I_{max} \ge 15.0$) 功能活性一票否决制质控红线 (Induction Dynamic Range Validation)

为了阻断由于长期传代且不加选择性抗生素导致的 hAR 或 ARE-Luc 报告基因质粒脱落丢失、或者是防范因受体表达下调导致的测试系统失灵，质控部门或研究人员必须在细胞株连续传代每超过 10 代或每次建立新主代种子库时，提取细胞，执行硬性的 OECD TG 458 转录激活功能一票否决制质控：

1. 检测方法：取对数生长的细胞，接种于 96 孔白板中，使用 BioVector® Phenol Red-Free Assay Testing Medium（测试专用无激素培养基） 培养 24 小时进行激素饥饿。随后加入阳性对照 10 nM 双氢睾酮（Dihydrotestosterone, DHT） 刺激 24 小时。使用 BioVector® Luciferase Reporter Gene Assay Kit（萤火虫萤光素酶报告基因检测检测试剂盒） 读取化学发光相对光单位（RLU）。

2. 合格交付核心红线指标：在标准测试体系下，10 nM DHT 刺激组的 RLU 发光值与无刺激溶剂对照组（0.1% DMSO）的比值（最大诱导倍数 $Induction\ Fold, I_{max}$）必须恒定大于或等于极其坚固的质控底线 15.00 倍（即 $I_{max} = \frac{RLU_{10nM\ DHT}}{RLU_{Control}} \ge 15.00$）。这一高动态响应区间是确证其符合 OECD 官方试验指南认证、保留高灵敏 AR 转录激活响应功能的一票否决标准。

3. 一票否决处理规范：一旦质控检测发现该最大诱导倍数跌破 15.00 倍门槛线（例如测定值下降至 5-8 倍，表明质粒发生大面积沉默丢失或细胞受体发生脱敏变异），该生产或实验批次细胞执行一票否决红线制，全盘作废彻底灭菌销毁。绝对禁止向外交付该批次响应退化细胞或将其投入后续任何内分泌干扰物筛选、化学品安评或抗雄激素药敏测试的数据收集。必须立刻重新追溯清洗器皿，从液氮冷冻库中复苏 pristine 原始极低代次的无质粒丢失 BioVector® AR-EcoScreen 种子冷冻管，并在包含 G418/潮霉素 B 的双抗筛选压力下重新开启扩增与功能质控循环。(Enforce a rigid, non-negotiable functional-level verification gatekeeper: the dynamic luciferase bio-luminescence induction fold ($I_{max}$) under standard 10 nM DHT challenge must stay consistently at or above the strict regulatory threshold line of 15.00-fold relative to vehicle controls. If the operational analysis falls below this key 15.00-fold demarcation line, it flags a catastrophic reporter gene silencing or receptor loss event; invoke the absolute system veto to abort the running lines instantly and re-propagate expansion loops using pristine early-passage BioVector® AR-EcoScreen master seeds under antibiotic selection pressure exclusively.)

BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

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