BioVector® TMNK-1 人正常肝窦内配细胞永生化株 / BioVector® TMNK-1 Immortalized Human Normal Sinusoidal Endothelial Cell Line

1 细胞基本信息与培养表型 / Cell Identification and Morphological Profiling

• 细胞名称 (Cell Name)：BioVector® TMNK-1 人正常肝窦内皮细胞永生化株 (BioVector® TMNK-1 Immortalized Human Normal Sinusoidal Endothelial Cell Line)

• 组织来源 (Tissue Origin)：人类正常肝脏组织（通过转导人类大 T 抗原 Simian Virus 40 large T antigen / SV40T 基因成功打破海弗里克极限，建立的长效非肿瘤源性永生化人肝窦内皮细胞系。该细胞在无限增殖的同时，高度保留了微血管内皮细胞特有的窗孔结构与屏障摄取表型）。

• 生长特性 (Growth Properties)：严格贴壁生长 (Strictly Adherent)。

• 细胞形态 (Cell Morphology)：典型的长梭形、不规则形或长多角形上皮/内皮样（Endothelial-like）。细胞在低密度栽培时呈现舒展的伪足，高密度汇合后形成极其致密的单层网状“铺路石状”排列，且表现出明显的接触抑制特性。(Presents distinct elongated, spindled, endothelial-like single-cell tracks, developing tightly packed mesh-like cobblestone formations upon saturation.)

• 安全等级 (Biosafety Level)：2 级安全控制（BSL-2，因含有 SV40T 永生化病毒片段，仅限体外科研使用，严禁用于临床人类细胞治疗或再生医学制剂制备）。

2 分子细胞生物学特征与肝脏微环境屏障模型价值 / Molecular Dynamics and SEC Validation

BioVector® TMNK-1 细胞株是全球肝脏纤维化（Liver Fibrosis）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝窦阻塞综合征（SOS）以及肿瘤肝转移微环境研究中应用最广泛的国际标准化内皮屏障替代模型：

The BioVector® TMNK-1 cellular platform preserves robust physiologic expression profiles governing human sinusoidal clearance and filtration networks, serving as a high-fidelity, non-tumorigenic alternative to unstable primary liver sinusoidal endothelial cells (LSEC):

内皮特异性标志物与功能受体高丰度表达 (Conservation of Endothelial Profiles)

与外周大血管内皮细胞（如 HUVEC 脐静脉内皮细胞）截然不同，BioVector® TMNK-1 细胞在良性栽培环境下能够高水平维持肝窦内皮细胞（LSEC）特有的清道夫受体与屏障标志物转录活性：

• 核心内皮质控红线 (Endothelial Biomarkers)：稳定表达人类最核心的内皮剪切标志物 CD31（PECAM-1）、vWF（血管性血友病因子）。

• 肝窦内皮特异性受体 (LSEC-Specific Scavenger Markers)：高水平表达具有特征性的 稳定蛋白-2（Stabilin-2） 以及 LYVE-1（淋巴管内皮透明质酸受体-1）。这使得该细胞系具备对胞外透明质酸（Hyaluronic Acid）以及变性胶原的高效内吞与清除功能，是评估肝纤维化进程中肝窦“毛细血管化（Capillarization）”退行性变的核心窗口。(Stably expresses native master endothelial determinants including CD31, vWF, and specialized LSEC-specific markers like Stabilin-2 and LYVE-1 to dictate sinusoidal lineage fidelity.)

3 细胞完全培养基配方与防变性贴壁维持规范 / Routine Culturing and Matrix Stabilization Specifications

核心红线规程 / Matrix-Coating and Adherence Warning

TMNK-1 细胞作为高度特异化的微血管内皮细胞，其贴壁性能与表面接触力学高度依赖外源胞外基质。严禁将其直接接种在未经任何修饰的裸塑料培养瓶/培养皿上，否则会导致细胞发生自发性收缩变圆、大面积浮空并成批老化死亡。在复苏或传代接种前的 45 分钟，必须强制使用 BioVector® Extracellular Matrix Fibronectin（高纯度人/牛血浆纤连蛋白包被液） 或 BioVector® Collagen I（鼠尾 I 型胶原蛋白） 对所有培养器皿表面进行无菌涂布预处理。此外，为了防止细胞在连续单层栽培中丢失内皮分化表型，换液和消化必须使用经过严格筛选、富含内皮特定生长因子的专属完全培养基。(TMNK-1 cells will fail to adhere and undergo swift death on non-coated plastic grids. Pre-coat all vessels using BioVector® Fibronectin or Collagen I solution for 45 minutes, and execute programmatic passages cleanly at 85% confluence to block lineage drift.)

基础与完全培养基组分配方 / Complete Feeding Matrix Formulation

• 基础培养基 (Base Medium)：BioVector® Premium Endothelial Cell Basal Medium（高级内皮细胞基础培养基）。该基础培养基具有严格校准的血管生长因子本底适应线。

• 完全培养基配方与特异性内皮补剂添加 (Complete Culture Media & Supplements)：

  • BioVector® Endothelial Basal Medium：89%

  • BioVector® Premium Fetal Bovine Serum（内皮细胞专用特级胎牛血清 / FBS）：10%（该血清群经批次质控，确保促纤维化变异本底降至最低线）。

  • BioVector® Endothelial Cell Growth Supplements (内皮细胞专用生长因子复配添加剂 / 100X)：1%（内含精密配比的内皮生长因子 VEGF、碱性成纤维细胞生长因子 bFGF、肝素等，用以锁定其正常肝窦内皮细胞的转录分化表型）。

  • BioVector® Certified Penicillin-Streptomycin（优质双抗补剂）：1%

• 基质胶包被液 (Coating Substrate)：BioVector® Extracellular Matrix Fibronectin (纤连蛋白)，工作浓度通常为 1-2 ug/cm²（用无菌 PBS 稀释后加入瓶中，37 摄氏度孵育 45 分钟，接种前吸除多余液体即可）。

标准物理培养环境 (Incubation Parameters)

• 气体与温度控制 (Atmospheric Setup)：标准恒温加湿孵箱，设定运行温度为 37 摄氏度，连续输入 5% 二氧化碳 ($\text{CO}_2$)。

4 细胞冻存管复苏、连续传代与冷冻保存工作流 / Thawing, Passage, and Cryopreservation Workflows

A 阶段：细胞库冻存管的复苏启动 / Phase A: Cryovial Thawing

1. 提前对 T25 细胞培养瓶 进行 BioVector® Fibronectin 表面包被，处理完毕后在超净台内放置备用。

2. 从液氮罐气相层中小心移出 BioVector® TMNK-1 细胞冻存管，立刻完全浸没在 37 摄氏度恒温水浴锅中高频快速晃动，在 1 到 2 分钟内彻底融化。

3. 在无菌超净台内，将融化的细胞悬液缓慢注入含有 5 mL 预热的 BioVector® 内皮完全培养基的 15 mL 无菌离心管中。

4. 以 1000 乘以 g 离心 4 分钟，彻底倒掉含有高浓度 DMSO 毒性的旧上清液。

5. 加入 5 mL 新鲜的内皮完全培养基轻柔重悬细胞沉淀，平稳接种至预先包被好的 T25 瓶中，移入孵箱栽培。

B 阶段：日常贴壁细胞传代操作 / Phase B: Subculturing Method

1. 当瓶内贴壁细胞覆盖密度达到 80% 至 85% 汇合度（呈现致密的密接内皮样单层）时，必须启动传代。切勿让细胞达到 100% 满瓶状态过夜，否则细胞会因高度挤压接触抑制而迅速老化死亡或发生自发性内皮-间质转化（EndMT）。

2. 吸除旧完全培养基。使用无菌的 BioVector® PBS（不含钙镁平衡盐洗涤液） 轻柔润洗细胞层 1 次。

3. 向原培养瓶中加入 1.0 mL BioVector® Trypsin-EDTA（0.25% 传统工程胰蛋白酶消化液）。置于 37 摄氏度孵箱中消化 1 到 2 分钟。

4. 镜下终止红线：消化期间需密切在显微镜下盯防。一旦发现细胞边缘收缩、变圆并有大面积松动迹象，立刻加入双倍体积的预热完全培养基终止消化。用血清枪轻柔吹打瓶壁 3 次。传代比例严格限定在 1比2 到 1比3 之间，分配接种到新包被的无菌培养瓶中。

C 阶段：高品质细胞冻存株建立 / Phase C: Safe Cryopreservation

1. 收集处于对数生长最旺盛、内皮形态完好的低代次 TMNK-1 细胞沉淀。

2. 配制高级细胞冻存基质液，推荐组分为：BioVector® Endothelial Basal Medium（55%）+ BioVector® Premium FBS（35%）+ BioVector® Cryo-Grade DMSO（10%）；或直接选用一体化无菌型的 BioVector® Cellular Cryopreservation Medium 专用无血清快速冻存液。

3. 调整细胞重悬密度至 2 乘以 10^6 到 4 乘以 10^6 个细胞/mL，分装入微量无菌冻存管。放入 BioVector® Programmed Cooling Container（细胞程序降温盒） 中，立刻移入零下 80 摄氏度冰箱放置过夜。24 小时内必须将冻存管转移至液氮罐（零下 196 摄氏度）中进行长期冷冻储存。

5 支原体监控与 CD31 标志物高丰度维持一票否决制质控红线 / Downstream Quality Control Metrics

支原体污染红线熔断消杀 (Mycoplasma Surveillance)

TMNK-1 细胞作为微血管内皮模型，一旦发生隐性支原体（Mycoplasma）污染，支原体的内源代谢毒素会强烈干扰内皮紧密连接复合体的转录，导致血管内皮屏障通透性大面积人为恶化，使科研药筛数据完全失真。必须每 4 周对细胞进行支原体 PCR 筛查。

使用 BioVector® Mycoplasma PCR Detection Kit（支原体高灵敏 PCR 检测试剂盒） 扩增上清。一旦电泳检测在目标区间出现阳性污染条带，必须立即执行红线熔断消杀：彻底将该污染批次的细胞瓶高压灭菌（121 摄氏度），并对孵箱等全部空间使用 BioVector® Mycoplasma Disinfectant Spray（支原体专用高效消杀喷剂） 进行多轮饱和喷洒，随后重新复苏原始低代次无污染种子细胞。(Any trace contamination resolved by the BioVector® Mycoplasma PCR Kit commands a comprehensive red-line system shutdown: autoclave running lines at 121 degrees Celsius and disinfect the environmental footprints with BioVector® Mycoplasma Disinfectant Spray.)

内皮核心标志物 CD31 表达本底一票否决制质控红线 (CD31 Expression QC Metric)

为了确证对外交付或实验运行的 BioVector® TMNK-1 细胞株没有发生由于过量传代、恶性内皮-间质转化（EndMT）引发的“表型退化行为”，质控部门或研究人员必须在栽培传代每超过 8 代时，提取细胞总蛋白质，平行执行经典的特异性功能质控：

1. 检测方法：使用 BioVector® 蛋白质印迹分析系统（Western Blot） 或流式细胞术，测定细胞表面核心内皮分化标志物 CD31（PECAM-1） 的相对空间表达丰度，并与代表成纤维/间质退化的标志物 波形蛋白（Vimentin） 进行比对。

2. 合格交付核心红线指标：在正常的完全培养基栽培状态下，该细胞系的内皮分化表型必须呈现极其干净的强阳性特征，其经条带灰度换算的 CD31 蛋白表达丰度与内源内参的灰度比值必须恒定大于或等于 0.50。这一高水平分泌本底是确证其保留正常人肝窦内皮细胞系身份的一票否决标准。

3. 一票否决处理规范：一旦 Western Blot 定量检测发现该 CD31 蛋白表达灰度比值跌破 0.50 门槛线，确证该批次内皮细胞已发生不可逆的表型退化或脱分化。该生产或实验批次细胞执行一票否决红线制，全盘作废彻底灭菌销毁，绝对禁止对外交付或用于后续下游任何肝微环境生理数据的实验收集。必须立刻重新从液氮冷冻库中复苏低代次、形态完好的原始种子克隆重新进行扩增。(Enforce a rigid, non-negotiable protein-level expression gatekeeper: the quantified functional band intensity of CD31 molecules over control housekeeping tracks must stay consistently at or above the threshold line of 0.50. If the profile drops below this functional metric line during routine verification, it indicates target endothelial decay; invoke the absolute system veto to dump the active flasks instantly and restart the SEC expansion loops from early-passage cryopreserved master seeds.)

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