BioVector® Fa2N-4 人正常肝样细胞永生化株 / BioVector® Fa2N-4 Immortalized Human Normal Hepatocyte-like Cell Line

1 细胞基本信息与培养表型 / Cell Identification and Morphological Profiling

• 细胞名称 (Cell Name)：BioVector® Fa2N-4 人正常肝样细胞永生化株 (BioVector® Fa2N-4 Immortalized Human Normal Hepatocyte-like Cell Line)

• 组织来源 (Tissue Origin)：人类正常肝脏组织（通过转导人类大 T 抗原 Simian Virus 40 large T antigen / SV40T 基因成功打破海弗里克极限，建立的长效非肿瘤源性永生化人正常肝细胞系。该细胞在无限增殖的同时，高度保留了原代人肝细胞特有的药物代谢酶系与分泌表型）。

• 生长特性 (Growth Properties)：严格贴壁生长 (Strictly Adherent)。

• 细胞形态 (Cell Morphology)：典型的多角形上皮样（Epithelial-like）。细胞体积较大，胞质内富含密集的颗粒状细胞器，核大而圆且常可见双核现象，高密度汇合后呈现经典的“铺路石状”排列。(Presents large, polygonal, epithelial-like single-cell tracks with rich, granular cytoplasm and distinct multinucleation, developing tightly packed cobblestone formations upon saturation.)

• 安全等级 (Biosafety Level)：2 级安全控制（BSL-2，因含有 SV40T 永生化病毒片段，仅限体外科研使用，严禁用于临床人类细胞治疗或再生医学制剂制备）。

2 分子细胞生物学特征与药物代谢诱导模型价值 / Molecular Dynamics and ADME Validation

BioVector® Fa2N-4 细胞株是全球新药临床前研发、早期药物代谢动力学（ADME）、体外肝毒性（Hepatotoxicity）高通量初筛中应用最广泛的国际标准化正常人肝细胞替代模型：

The BioVector® Fa2N-4 cellular platform preserves robust physiologic expression profiles governing human hepatic clearance networks, serving as a high-fidelity, non-tumorigenic alternative to unstable primary human hepatocytes (PHH):

完整的细胞色素 P450 (CYP450) 酶系与转运体本底 (Conservation of Phase I/II Enzyme Cascades)

与常规的肝癌细胞（如 HepG2 极度丧失药代酶功能）截然不同，BioVector® Fa2N-4 细胞在良性栽培环境下能够高水平维持第一相和第二相药物代谢酶的转录与功能活性：

• 核心 CYP 酶谱功能 (Active CYP Isoforms)：稳定表达人类最核心的药物清除酶，包括 CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 以及最具一票否决制的 CYP3A4。

• 酶诱导特异性应答 (Enzyme Induction Profiles)：该细胞保留了经典的核受体调控网络（如 PXR、CAR 和 AhR）。当受到外源标准诱导剂利福平（Rifampicin）或苯巴比妥（Phenobarbital）刺激时，能诱发下游 CYP3A4 蛋白表达量呈数倍至数十倍的特异性亢进反应。

• 血浆蛋白与解毒分泌 (Hepatic Secretory Competency)：内源性持续稳定合成并分泌人类白蛋白（Albumin）以及尿素（Urea），高度模拟天然肝小叶肝细胞的同质化代谢排毒功能。(Maintains key metabolic and clearancy features including human serum albumin synthesis, robust urea conjugation, and fully responsive CYP3A4 enzyme induction cascades via active PXR/CAR transcriptional machinery.)

3 细胞完全培养基配方与防脱落包被维持规范 / Routine Culturing and Matrix Stabilization Specifications

核心红线规程 / Matrix-Coating and Adherence Warning

Fa2N-4 细胞分化程度极高，贴壁性能对基质环境极度敏感。严禁将其直接接种在未经任何修饰和包被的普通塑料培养瓶/培养皿上，否则会导致细胞发生自发性悬浮、聚集老化并成批坏死崩溃。在复苏或传代接种前的 45 分钟，必须强制使用 BioVector® Extracellular Matrix Collagen I（高纯度抗体级/常规级鼠尾 I 型胶原蛋白包被液） 对所有培养皿表面进行无菌涂布预处理。此外，为了维持其高度分化的 CYP 酶系本底不发生“去分化退化”，必须完全禁止使用普通的高糖或低糖 DMEM，必须全程强制依赖专用的无血清分化维持培养基系统。(Fa2N-4 cells will fail to adhere and undergo swift apoptotic death on non-coated plastic grids. Pre-coat all vessels using BioVector® Collagen I solution for 45 minutes, and strictly avoid common DMEM formulas in favor of specialized serum-free hepatocyte formulations.)

基础与完全培养基组分配方 / Complete Feeding Matrix Formulation

• 基础培养基 (Base Medium)：BioVector® MFE Specialized Hepatocyte Serum-Free Medium（MFE 专属肝细胞无血清支持基础培养基）。该基础培养基具有严格校准的微量元素平衡线。

• 完全培养基配方与特异性补剂添加 (Complete Culture Media & Supplements)：

  • BioVector® MFE Base Medium：98%

  • BioVector® Fa2N-4 Specialized Culturing Hormone Supplements (Fa2N-4 细胞专用激素及生长因子复配补剂 / 100X)：1%（内含精密配比的去氢皮质酮、胰岛素、人表皮生长因子 EGF 等，用以锁定其正常人肝样细胞的转录分化表型）。

  • BioVector® Certified Penicillin-Streptomycin（优质双抗补剂）：1%

• 基质胶包被液 (Coating Substrate)：BioVector® Extracellular Matrix Collagen I (I 型胶原蛋白)，工作浓度通常为 5 ug/cm²（用无菌 0.02 M 乙酸或无菌 PBS 稀释后加入瓶中，37 摄氏度孵育 45 分钟，接种前用无菌 PBS 润洗 2 次）。

标准物理培养环境 (Incubation Parameters)

• 气体与温度控制 (Atmospheric Setup)：标准恒温加湿孵箱，设定运行温度为 37 摄氏度，连续输入 5% 二氧化碳 ($\text{CO}_2$)，空气相对湿度恒定维持在 95% 以上。

4 细胞冻存管复苏、连续传代与冷冻保存工作流 / Thawing, Passage, and Cryopreservation Workflows

A 阶段：细胞库冻存管的复苏启动 / Phase A: Cryovial Thawing

1. 提前对 T25 细胞培养瓶 进行 BioVector® Collagen I 表面包被，处理完毕后在超净台内放置备用。

2. 从液氮罐气相层中小心移出 BioVector® Fa2N-4 细胞冻存管，立刻完全浸没在 37 摄氏度恒温水浴锅中高频快速晃动，在 1 到 2 分钟内彻底融化。

3. 在无菌超净台内，将融化的细胞悬液缓慢注入含有 5 mL 预热的 BioVector® MFE 肝细胞完全培养基的 15 mL 无菌离心管中。

4. 以 800 乘以 g 离心 4 分钟（该细胞体积偏大且质地脆弱，离心转速需适度放低），彻底倒掉含有高浓度 DMSO 毒性的旧上清液。

5. 加入 5 mL 新鲜的完全培养基轻柔重悬细胞沉淀，平稳接种至预先包被好的 T25 瓶中，移入孵箱栽培。

B 阶段：日常贴壁细胞传代操作 / Phase B: Subculturing Method

1. 当瓶内贴壁细胞覆盖密度达到 80% 至 85% 汇合度（呈现致密的密接上皮样单层）时，必须启动传代。切勿让细胞达到 100% 满瓶，否则细胞会因高度挤压接触抑制而自发启动不可逆的去分化或分层脱落。

2. 吸除旧完全培养基。使用无菌的 BioVector® PBS（不含钙镁平衡盐洗涤液） 轻柔润洗细胞层 1 次。

3. 向原培养瓶中加入 1.0 mL BioVector® Trypsin-EDTA（0.05% 极低浓度专用胰蛋白酶消化液）。置于 37 摄氏度孵箱中消化 2 到 3 分钟。

4. 镜下终止红线：由于细胞间紧密连接极为发达，消化期间需密切在显微镜下盯防。一旦发现细胞边缘收缩、变圆并有大面积松动迹象，立刻加入 3 mL 预热的完全培养基终止消化。用血清枪极其轻柔地吹打瓶壁 3-5 次。传代比例严格限定在 1比2 到 1比3 之间，分配接种到新包被的无菌培养瓶中。

C 阶段：高品质细胞冻存株建立 / Phase C: Safe Cryopreservation

1. 收集处于对数生长最旺盛、上皮形态完好的低代次 Fa2N-4 细胞沉淀。

2. 配制高级无血清专用细胞冻存液，推荐组分为：BioVector® MFE Base Medium（80%）+ BioVector® Cryo-Grade DMSO（10%）+ BioVector® High-Purity Bovine Serum Albumin（10% 高纯度牛血清白蛋白作为大分子保护剂）；或直接选用一体化无菌无血清型的 BioVector® Cellular Cryopreservation Medium 专用冻存液。

3. 调整细胞重悬密度至 2 乘以 10^6 到 3 乘以 10^6 个细胞/mL，分装入微量无菌冻存管。

4. 将冻存管放入 BioVector® Programmed Cooling Container（细胞程序降温盒） 中，立刻移入零下 80 摄氏度冰箱放置过夜。24 小时内必须将冻存管转移至液氮罐（零下 196 摄氏度）中进行长期冷冻储存。

5 白蛋白分泌本底与支原体隐性污染一票否决制质控红线 / Downstream Quality Control Metrics

支原体污染红线熔断消杀 (Mycoplasma Surveillance)

Fa2N-4 细胞一旦发生隐性支原体（Mycoplasma）污染，其胞内的 PXR/CAR 核受体基因链会遭到彻底的表观遗传沉默，导致全盘丧失药物代谢酶诱导表型，使科研药筛数据完全失真。必须每 4 周对细胞进行支原体 PCR 筛查。

使用 BioVector® Mycoplasma PCR Detection Kit（支原体高灵敏 PCR 检测试剂盒） 扩增上清。一旦电泳检测在目标区间出现阳性污染条带，必须立即执行红线熔断消杀：彻底将该污染批次的细胞瓶高压灭菌（121 摄氏度），并对孵箱等全部空间使用 BioVector® Mycoplasma Disinfectant Spray（支原体专用高效消杀喷剂） 进行连续多轮饱和喷洒，随后重新复苏原始低代次无污染种子细胞。(Any baseline verification of mycoplasma contamination triggers an immediate red-line shutdown: autoclave running lines at 121 degrees Celsius and erase the space using BioVector® Mycoplasma Disinfectant Spray.)

人类白蛋白（Human Albumin）基础分泌率一票否决制质控红线 (Albumin Expression QC Metric)

为了确证对外交付或实验运行的 BioVector® Fa2N-4 细胞株没有发生由于恶性传代、去分化、或者被恶性肿瘤细胞（如 HeLa 或普通的成纤维细胞）发生隐性交叉污染顶替，质控部门或研究人员必须在栽培传代每超过 8 代时，收集细胞连续培养 24 小时的无血清上清液，执行经典的定量功能质控：

1. 检测方法：使用 BioVector® Human Albumin ELISA Quantitation Kit（高灵敏人类白蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒），利用配套的 BioVector® 多功能分光光度酶标仪 测定上清液中人类白蛋白的绝对分泌质量分值，并根据贴壁细胞总数进行标准化换算。

2. 合格交付核心红线指标：在正常的无血清分化维持培养基栽培状态下，该细胞系的 人类白蛋白（Human Albumin）基础分泌速率必须恒定大于或等于 1.5 ug / (10^6 cells · 24 hours)。这一高水平分泌本底是确证其保留正常人肝细胞系身份的一票否决标准。

3. 一票否决处理规范：一旦 ELISA 定量检测发现该白蛋白基础分泌速率跌破 1.5 ug 的红线门槛，甚至测定值趋近于零，确证该批次肝样细胞已发生严重的表型退化去分化，或者已经发生了外源非肝源性细胞的交叉污染。该发酵生产批次细胞执行一票否决红线制，严禁向外交付或进入任何 ADME 毒理实验数据收集。必须立刻对当前运行的细胞瓶全盘高压灭菌消杀，并彻底追溯清洗消杀所有可能受污染的培养环境，重新从液氮冷冻库中复苏 pristine 原始代次的无污染种子冷冻管起步扩增。(Enforce a rigid, non-negotiable protein-level secretion gatekeeper: the quantified functional output of human albumin in the cellular supernatants must stay consistently at or above the threshold line of 1.5 ug per million cells over a 24-hour cycle. If the expression rate drops below this functional metric line, it signals an immediate cell-line decay or identity cross-contamination; invoke the absolute system veto to dump the active flasks instantly and restart the hepatocyte expansion loops from early-passage cryopreserved master seeds.)

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