BioVector® pT7-αND/βND/γND 大麦条纹花叶病毒(BSMV)体外转录质粒系统 / BioVector® pT7-αND, pT7-βND, and pT7-γND Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) In Vitro Transcription Plasmid System

1 产品基本信息与转录架构 / System Architecture and Viral Taxonomy

• 产品名称 (Product Name)：BioVector® pT7-αND、pT7-βND、pT7-γND 大麦条纹花叶病毒体外转录基因沉默与表达质粒系统 (BioVector® pT7-αND, pT7-βND, and pT7-γND Barley Stripe Mosaic Virus In Vitro Transcription Plasmid System)

• 系统类型 (Vector System)：植物RNA病毒体外转录双元系统、大麦条纹花叶病毒（BSMV）三部基因组 T7 启动子转录框 (Tripartite ssRNA Viral Vector System for In Vitro Transcription)

• 克隆复制子与细菌筛选标记 (Replication Loci and Selection Markers)：

  • 大肠杆菌复制子 (Bacterial Ori)：pUC ori（高拷贝复制子，利于大肠杆菌宿主内质粒的高得率提取）。

  • 细菌筛选标记 (Bacterial Selection Marker)：Ampicillin（Amp 属性，氨苄青霉素抗性），大肠杆菌培养常规工作浓度为 100 ug/mL。

• 三部基因组转录盒配置 (Tripartite Genome Topology)：

  BSMV 基因组由三条独立的单股正链 RNA（RNA $\alpha$, RNA $\beta$, RNA $\gamma$）组成。本系统将三条病毒基因组全长 cDNA 分别精确克隆在强效 T7 启动子（T7 Promoter） 下游，用于通过 T7 RNA 聚合酶在体外爆发式转录出具有侵染活性的病毒 RNA：

  1. pT7-αND (RNA $\alpha$)：编码 $\alpha a$ 蛋白（复制酶核心解旋酶与聚合酶组分），介导病毒 RNA 在宿主胞内的自主高丰度复制。

  2. pT7-βND (RNA $\beta$)：编码病毒的外壳蛋白（CP）以及三基因座运动蛋白（TGB1, TGB2, TGB3），负责病毒颗粒的胞间运动与长距离维管束运输。

  3. pT7-γND (RNA $\gamma$)：编码复制酶辅助因子（$\gamma a$ 蛋白）和致病性/RNA沉默抑制子（$\gamma b$ 蛋白）。在 ND 工程化修饰骨架中，在 $\gamma b$ 基因下游嵌入了多克隆位点（MCS），专用于插入 150-300 bp 的植物内源靶基因片段，用以诱导病毒介导的基因沉默（VIGS）。

2 分子植物病毒学特征与 VIGS 基因沉默模型价值 / Molecular Dynamics and VIGS Bio-assays

BioVector® pT7-αND/βND/γND 系统是现代单子叶植物（如小麦、大麦、燕麦、玉米）分子生物学研究中，用于高通量鉴定抗病基因、抗逆基因以及株型发育基因功能的核心工具：

The BioVector® BSMV tripartite in vitro transcription platform delivers direct synthesis of infectious cap-analoged RNA $\alpha$, $\beta$, and $\gamma$ molecules, activating sequence-specific post-transcriptional gene silencing (VIGS) across recalcitrant cereal crop variants:

体外转录 RNA 摩擦侵染的高效性 (Advantages of In Vitro RNA Mechanical Inoculation)

相比于传统的农杆菌浸润法（Agro-infiltration），直接利用体外转录合成的病毒 RNA 混合物摩擦接种单子叶植物具有不可替代的优势：

• 规避农杆菌侵染宿主限制 (Agrobacterium-Free Delivery)：小麦、大麦等单子叶植物对农杆菌天然不敏感，叶片质地坚硬，农杆菌注射极易失败。而体外转录的 RNA 溶液可直接通过机械摩擦法破开叶绿体角质层，直接进入叶肉细胞开启病毒复制流。

• 起效速度快且同步性高 (Rapid Synchronized Silencing)：重组病毒 RNA 链无需等待农杆菌在胞内释放并转录 T-DNA，进入细胞后可直接作为 mRNA 翻译出复制酶，在 5-7 天内即可在全株引爆高效的系统性 RNA 干扰（RNAi），特异性降解宿主靶标 mRNA。(By-passes the complex Agrobacterium T-DNA nuclear translocation step, triggering synchronized, hyper-fast viral genome replication and subsequent Dicer-like siRNA cleavage cascades directly inside cereal host cells.)

3 宿主大肠杆菌扩增与质粒遗传稳定性维持规范 / Bacterial Amplification Protocols

核心红线规程 / Critical Plasmid Stability Warning

BSMV 病毒载体（特别是包含庞大 cRNA 复制酶组件的 pT7-αND 质粒）在大肠杆菌中连续扩增传代时，具有极高频的“自发同源重组与突变丢失”倾向。大肠杆菌为了减轻自身的代谢负载，极易在 37 摄氏度下自发将病毒长全长基因组、启动子结合区或重复序列进行剪切变短，导致质粒彻底废弃。全流程大肠杆菌栽培温度必须强制限制在 30 摄氏度，绝对禁止使用 37 摄氏度高温发酵，且必须选用特异性低重组宿主菌株。

Because these heavy viral sequences are highly prone to recombination drop-outs during standard host propagation, cultivation at 37 degrees Celsius systematically induces structural truncations. You must restrict the proliferation temperature strictly to 30 degrees Celsius inside certified low-recombination competent chassis.

推荐宿主菌株与培养基配方 / Authorized Bacterial Host and Broth Rules

• 推荐大肠杆菌宿主 (Mandatory E.coli Host)：BioVector® Stbl3 或 BioVector® Stable 感受态细胞（具备 $recA1$ 和 $endA1$ 双重遗传缺陷，最大极限锁死多质粒长片段全长系统的拓扑结构）。

• 专用扩增培养基 (Growth Medium)：BioVector® LB Liquid Medium 液体培养基。

• 选择性抗性 (Antibiotic Pressure)：全程恒定添加 100 ug/mL BioVector® Ampicillin（氨苄青霉素）。

• 栽培物理运行参数 (Thermal Parameters - E.coli)：全程必须在 30 摄氏度 下进行恒温低速震荡培养（转速控制在 180 rpm），连续扩增时间限制在 14 到 16 小时。质粒抽提回收后，必须平行使用限制性内切酶切酶进行酶切电泳鉴定（Restriction digestion profiling），严格复核骨架与病毒插入片段的条带丰度比，确证无基因片段自发缩短现象。

4 体外转录、帽类似物加帽与麦类叶片摩擦侵染工作流 / In Vitro Transcription and Mechanical Inoculation Workflow

A 阶段：质粒高保真线性化与体外转录加帽 / Phase A: Linearization and In Vitro Transcription

1. 高保真单酶切线性化 (Linearization Target)：由于体外转录要求转录在病毒基因组尾端精确终止，必须使用不切断病毒内部序列的特异性限制性内切酶（如 MluI 或 SpeI），分别将 pT7-αND、pT7-βND、pT7-γND（含靶基因片段）进行完全线性化酶切。

2. 使用酚-氯仿抽提或 BioVector® PCR Clean-Up Kit（高效核酸纯化回收试剂盒） 回收线性化 DNA 骨架，确保无任何核酸酶残留。

3. 体外转录加帽反应 (In Vitro Cap-Analoged Transcription)：在无 RNase 的超净微量管中，利用 BioVector® T7 High-Yield RNA Synthesis Kit（T7 高产量 RNA 体外转录试剂盒） 搭建反应体系。

4. 真核翻译加帽红线 (Cap-Analog Requirement)：反应体系中必须额外复配高纯度的 BioVector® m7G(5')ppp(5')G Cap Analog（帽类似物）（控制 GTP 与 帽类似物的摩尔比为 1:4），确保体外合成出的病毒 $ssRNA$ 带有标准的 $5'$ 端 7-甲基鸟苷帽状结构。未加帽的病毒 RNA 在进入植物胞质后会被内源核酸外切酶瞬间降解，导致侵染率归零。(The incorporation of BioVector® m7G Cap Analog is an absolute baseline requirement to structurally shield the synthesized viral cRNA molecules from swift exonuclease clearance inside the plant cytoplasm.)

5. 转录结束后，加入 BioVector® RNase-Free DNase I 消化消除模板质粒 DNA，并通过超滤或固相抽提回收纯净的 RNA $\alpha$、$\beta$、$\gamma$ 三种组分。

B 阶段：等摩尔比混合与麦类幼苗叶片机械摩擦接种 / Phase B: Leaf Mechanical Inoculation

1. 选择生长至 2 叶期的健康小麦或大麦幼苗（接种前 24 小时进行高湿度遮光遮光处理，使叶肉细胞角质层变薄）。

2. 等摩尔比复配核心红线（Crucial 1:1:1 RNA Mixing）：使用分光光度计精确测定三种体外转录 RNA 的浓度。将 $\alpha$、$\beta$、$\gamma$ 三种重组病毒 RNA 按照 1:1:1 的绝对等质量/等摩尔比例混匀在同一个无菌冰育管中（每株植物的推荐接种量为各组分 1 至 2 ug）。(To ensure stoichiometric viral genomic reconstitution, blend the in vitro transcribed RNA $\alpha$, $\beta$, and the gene-carrying $\gamma$ structures together at a strict 1:1:1 ratio upon an ice matrix.)

3. 向混合 RNA 液中加入等体积的 BioVector® Plant Lysis Infiltration Buffer（植物叶片摩擦侵染维持液，内含微量磷酸盐缓冲体系及甘氨酸）。

4. 在待接种的小麦幼苗第一叶或第二叶表面，均匀散上极其微量的 BioVector® Carborundum（高级金刚砂摩擦助剂 / 400-600目）。

5. 戴上无菌一次性乳胶手套，用手指蘸取含有混合病毒 RNA 的溶液，在有金刚砂的麦类叶片表面沿同一方向轻柔、平稳地涂抹摩擦 2-3 次。金刚砂制造的微观创口能让重组 BSMV $ssRNA$ 颗粒畅通无阻地涌入叶肉细胞。

6. 摩擦接种后，立刻使用灭菌超纯水细雾轻柔喷洒叶片，洗去多余的金刚砂，并使用无菌塑料膜将整盆麦苗进行完全包裹，移入高湿度（相对湿度 90% 以上）、23-25 摄氏度 的遮光孵育箱内强制盲培 24 小时，随后转入常规植物生长室栽培。(Following manual rubbing assisted by BioVector® Carborundum, mist the seedlings with sterile water and lock the pots inside a high-humidity dark chamber for 24 hours to accelerate initial viral integration pathways.)

5 VIGS 基因沉默表型层析质控红线 / Downstream Phenotypic Quality Control Metrics

阳性对照组叶片白化（PDS白化对照）一票否决制红线 (Validation via Positive Control PDS Bleaching)

由于植物病毒系统在体外转录及体内扩增期间，极易由于空间位阻或高频复制而自发发生“外源片段选择性剪切与丢失”（Insert Deletion/Purge），导致沉默效率归零。实验设计中必须强制平行设置一组重组了植物 PDS（八氢番茄红素脱氢酶基因）特异性反义片段的 BioVector® pT7-γND-PDS 阳性对照体外转录转录侵染组：

1. 表型质控红线指标：接种重组 BSMV-PDS 转录 RNA 的小麦/大麦幼苗，在栽培至 接种后 10 到 14 天 时，其新抽出的第三叶、第四叶以及系统性扩散区域的整片叶肉组织，必须百分之百自发表现出典型、大面积且不发绿的“光氧化条带状白化表型”（Standard photo-bleaching strips）。这是 PDS 基因被强力 VIGS 阻断、导致全株叶绿素合成遭到彻底破坏的外显功能指标。

2. 红线熔断判定：如果在接种 14 天后，作为金标准验证的 PDS 阳性对照组麦苗依然维持满眼苍翠、未出现任何清晰可见的系统性白化条带，确证该批次体外转录转录出的 RNA 带有严重的突变丢失，或者加帽率不达标导致病毒在植物体内提前崩解。本批次所有平行进行的未知新基因沉默实验执行一票否决制，全盘作废。必须立刻彻底清理清除受污染的实验植物，使用 BioVector® Plant-Virus Erasing Spray（植物病毒专用高效化学清除剂） 连续三天饱和喷洒栽培温室，消除残留野毒本底后，重新线性化质粒，更换全新体外转录试剂盒重新开启加帽转录与接种循环。(An aggressive, non-negotiable functional control barrier: you must run a parallel experimental vector spike using the pT7-γND-PDS plasmid variant. At 10 to 14 days post-rubbing, the young cereal leaves must isolate prominent photo-bleaching tracks. If the positive control plants fail to display this bleaching standard, it alerts that the viral translation or sequence preservation failed; invoke the red-line veto to cancel the running batch immediately and refresh the in vitro synthesis matrix from pristine linearized master seeds.)

BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

电话:400-800-2947

工作QQ/微信同号:1843439339

网址http://www.biovector.net