BioVector® pGreenII 62-SK 植物高效瞬时表达载体 / BioVector® pGreenII 62-SK Plant High-Efficiency Transient Expression Vector

1 产品基本信息与转录框架 / Product Identification and Vector Architecture

• 产品名称 (Product Name)：BioVector® pGreenII 62-SK 植物高效瞬时表达载体 (BioVector® pGreenII 62-SK Plant High-Efficiency Transient Expression Vector)

• 产品类型 (Vector Type)：植物双元表达载体、微型高效率植物转基因/瞬时表达系统 (Miniaturized Plant Binary Expression Vector System)

• 克隆复制子与选择标记 (Replication Loci and Selection Markers)：

  • 广宿主复制子 (Broad-host-range Ori)：pSa replication origin（微型化的低拷贝广宿主复制子）。该载体为了极大缩减分子量、提升克隆效率，剥离了自身编码的复制必需蛋白（RepA）。因此，它在宿主大肠杆菌和农杆菌中稳定自主复制的前提，是必须由共存的辅助质粒（如 BioVector® pSoup）在反式状态下提供 RepA 蛋白支援，即经典的 pGreenII-pSoup 双质粒系统。(A mini-binary design utilizing the pSa replicon window. It lacks an embedded replication gene and strictly requires the trans-acting RepA protein supplied by a co-resident BioVector® pSoup helper plasmid to propagate within Agrobacterium hosts.)

  • 大肠杆菌与农杆菌双重筛选抗性 (Bacterial Selection Marker)：Kanamycin（Kan 属性，卡那霉素抗性）。在大肠杆菌和农杆菌中的工作浓度均为 50 ug/mL。

  • 植物细胞筛选标记 (Plant Selection Marker)：该 62-SK 专门优化版本中去除了常规的植物抗性筛选表达框（如潮霉素或除草剂），专门用于不依赖抗生素筛选的植物叶片高效瞬时表达（Transient Expression）或双荧光素酶转录调控分析（Dual-Luciferase Assay）。

• 核心核心转录盒配置 (Core Transcriptional Cassette Topology)：

  • 驱动启动子 (Driving Promoter)：双 CaMV 35S 启动子（2x35S Promoter）。通过串联重复的 35S 增强子序列，其转录驱动强度比常规单 35S 启动子大幅飙升 10 倍以上，能在双子叶植物叶肉细胞中引发极高丰度的外源蛋白转录积累。

  • 多克隆位点 (Multiple Cloning Site - MCS)：紧邻 2x35S 启动子下游，包含 EcoRI、SacI、KpnI、SmaI、BamHI、XbaI、SalI、PstI、SphI 和 HindIII 等一系列独特的限制性内切酶切位点，特别适合无缝插入各种植物转录因子（TF）或抗原表达框。

  • 终止子配置 (PolyA Terminator)：搭载了经典的 CaMV 35S polyA 终止子，确保植物细胞内转录产物 mRNA 的稳定与高效聚合。

2 分子植物生物学特征与瞬时表达模型价值 / Molecular Dynamics and Plant Bio-assays

BioVector® pGreenII 62-SK 载体是现代植物分子生物学中研究基因功能、蛋白质相互作用（如裂解荧光素酶互补实验 LCI）、以及转录调控网络（如双荧光素酶报告系统 Dual-Luciferase）的黄金标准工具：The BioVector® pGreenII 62-SK architecture represents a premium miniaturized framework designed for robust transient gene expression, in vivo protein-protein interaction traps (LCI), and high-throughput dual-luciferase transcriptional screening cascades within plant chassis:

超微型双元载体设计优势 (Advantage of the Miniaturized Binary Layout)

传统的植物双元载体（如 pCAMBIA 谱系）分子量通常在 10 kb 到 12 kb 以上，在大肠杆菌中克隆大片段基因时极易发生载体自发重组或严重降低克隆效率。BioVector® pGreenII 62-SK 通过将植物抗性框剥离，并剥离复制必需基因，将载体骨架分子量压缩至约 4.5 kb。这种超轻量化设计赋予了其极高的体外连接包容度与出色的转化效率，即使克隆超过 5 kb 的大型植物复合转录因子基因，依然能保持完美的结构遗传稳定性。(By externalizing active replication complexes to a helper block and truncating non-essential plant selectors, the vector collapses down to ~4.5 kb, heavily neutralizing insertion-associated deletions during long-chain cDNA cloning workflows.)

本氏烟草瞬时侵染模型的核心表型 (Transient Expression Phenotypes in Nicotiana benthamiana)

将构建成功的 BioVector® pGreenII 62-SK 重组质粒与 BioVector® pSoup 质粒共同转化农杆菌，随后通过注射法侵染本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片，该系统展现出以下核心优势：

• 无抗性基因背景干扰 (Zero Plant-Selector Noise)：在进行转录调控或瞬时启动子激活实验（Effector-Reporter system）时，由于 62-SK 骨架本身不表达任何可能干扰宿主植物细胞代谢的抗生素抗性蛋白（如吸热性潮霉素磷酸转移酶），能提供更为纯净、真实的内源基因表达背景反馈。(Ensures an ultra-clean bio-assay baseline free from metabolic background shifts or physiological necrosis occasionally induced by persistent plant antibiotic selection markers.)

• 高爆发式表达动力学 (Burst Kinetics)：得益于 2x35S 强启动子的控制，侵染后 48 到 72 小时内，叶片局部侵染区的目标基因蛋白表达量即可达到峰值平台期，是提取重组植物蛋白、纯化亚细胞微结构的理想动力学窗口。(Achieves maximized systemic transcript loads within 48 to 72 hours post-infiltration, establishing the optimal kinetics matrix for functional protein harvesting.)

3 宿主大肠杆菌与农杆菌扩增、共转化质粒维持规范 / Bacterial Propagation and Co-Transformation Protocols

警告 / Critical WarningpGreenII 62-SK 载体由于丢失了 pSa 复制子的 repA 基因，其本身在常规农杆菌（如 GV3101、EHA105）中完全无法进行自主复制。在转化农杆菌时，必须同时加入等体积的宿主复制辅助质粒 BioVector® pSoup（带有 Tetracycline 四环素抗性，10 ug/mL）进行共转化（Co-transformation）；或者必须强制选用已经提前预整合、预转入了 pSoup 质粒的专用农杆菌感受态细胞（如 BioVector® GV3101(pSoup) 专用高效率感受态），否则转化平板将完全无法长出任何Kan抗性阳性菌落。Because pGreenII 62-SK lacks an active replication core, it is fundamentally replication-deficient within Agrobacterium lines when isolated. You must either perform a dual co-transformation using an equal molar balance of the BioVector® pSoup helper plasmid, or strictly deploy pre-engineered Agrobacterium stocks like BioVector® GV3101(pSoup) Competent Cells. Failure to do so yields zero colony colonies on selection media.

选用的宿主菌株与大肠杆菌扩增规范 / Authorized Bacterial Hosts and Propagation

• 推荐大肠杆菌宿主 (Mandatory E.coli Host)：BioVector® Top10 或 BioVector® DH5a 基因工程大肠杆菌感受态细胞（单独扩增 62-SK 质粒时无需加 pSoup 质粒，单独的大肠杆菌自身支持其 pUC 复制子的单抗扩增 / E.coli hosts natively support the pUC ori framework embedded within the standalone vector without helper integration）.

• 大肠杆菌扩增培养基 (Growth Medium for E.coli)：BioVector® LB Liquid Medium 液体培养基。

• 大肠杆菌筛选抗性与温度 (Antibiotic Selection and Thermal Parameters for E.coli)：添加 50 ug/mL BioVector® Kanamycin（卡那霉素），在标准 37 摄氏度下恒温震荡培养（180 到 200 rpm） 14 到 16 小时即可高产量提取质粒。

4 农杆菌电转化与植物叶片瞬时侵染质控工作流 / Agrobacterium Transformation and Infiltration Workflow

A 阶段：农杆菌双质粒电穿孔转化 / Phase A: Agrobacterium Electroporation

1. 从零下 80 摄氏度深冷冰箱中取出一管 BioVector® GV3101(pSoup) 农杆菌高效电击感受态细胞，放置于冰上缓慢融化。

2. 加入 1 微克 构建正确的重组 BioVector® pGreenII 62-SK 质粒 DNA，轻柔混匀，冰浴 5 分钟。（注：若使用未整合 pSoup 的普通农杆菌，则需同时加入 1 微克 纯纯化好的 BioVector® pSoup 辅助质粒）。

3. 将混合物转移至无菌的 0.2 厘米 电击杯中，设置微量电穿孔仪运行参数：电压设定为 2.2 到 2.4 kV，电容设定为 25 uF，电阻平行设定为 400 到 600 欧姆，启动单次电击转导。(Discharge a single electrical pulse tailored for Agrobacterium cells: voltage set to 2.2-2.4 kV, capacitance at 25 uF, parallel resistance at 400-600 Ohms.)

4. 电击完成后，必须立刻注入 1.0 mL 预冷的无抗生素 BioVector® YEB 液体复苏培养基，轻柔混匀。

5. 置于 28 摄氏度恒温摇床中以 150 rpm 慢速复苏培养 2 到 3 小时，让卡那霉素耐药基因充分翻译表达。

6. 将复苏菌液低速离心浓缩，全量涂布于含有 50 ug/mL BioVector® Kanamycin（卡那霉素） 和 10 ug/mL BioVector® Tetracycline（四环素，用于锁死pSoup质粒不丢失） 的 YEB 固体琼脂平板上。(Plate the concentrated recovery broth onto BioVector® YEB selection plates fortified with 50 ug/mL Kanamycin and 10 ug/mL Tetracycline.)

7. 将平板置于 28 摄氏度恒温培养箱中倒置静置培养 48 小时，长出的乳白色针尖状单菌落即为成功构建的双质粒农杆菌工程菌株。

B 阶段：本氏烟草叶片瞬时侵染重悬与注射 / Phase B: Leaf Infiltration Sequence

1. 挑取验证正确的农杆菌单菌落，接种于含 50 ug/mL 卡那霉素和 10 ug/mL 四环素的 YEB 液体培养基中，28 摄氏度震荡培养至对数生长旺盛期（OD600 约 0.8）。

2. 以 4000 乘以 g 离心 8 分钟收集农杆菌菌体，彻底弃去上清液。

3. 使用专门配制的 BioVector® Agrobacterium Infiltration Buffer（植物侵染重悬缓冲液，内含 10 mM MgCl2、10 mM MES 以及 150 uM AS 乙酰丁香酮） 重悬菌体沉淀，稀释调整菌液最终的 OD600 至 0.6 到 0.8 之间。(Resuspend and dilute the Agrobacterium pellet using BioVector® Agrobacterium Infiltration Buffer supplemented with 150 uM Acetosyringone to a standard target OD600 metric of 0.6 to 0.8.)

4. 将重悬后的菌液置于室温下绝对静置避光活化 2 到 3 小时。乙酰丁香酮（AS）能强力诱导农杆菌 Vir 基因系统的启动活化，这是外源 T-DNA 成功切除并注入植物细胞的关键红线步骤。(Allow the suspension to actuate statically in the dark for 2 to 3 hours at room temperature to prime the Virulence gene apparatus via AS chemical stimulation.)

5. 选用生长期为 4 到 6 周、生长状态健康的本氏烟草，使用无菌的 1 mL 一次性注射器（去掉金属针头），从烟草叶片背面（远轴端）的微小气孔处轻柔压紧并推注菌液。可见菌液在叶肉组织间隙迅速蔓延扩散，直至整片叶片呈现完全水渍状浸润。

6. 将侵染后的烟草植株移回植物培养室，按照常规光照周期（16 小时连续光照/8 小时黑暗，25 摄氏度）继续栽培。

5 瞬时表达终点功能确证与载体突变丢失红线质控 / Functional Assays and Downstream QC

• 多重启动子活性与表达量终点质控 (Validation and Detection Assays)：在侵染后的 第 3 天（加药/注射后约 60 到 72 小时），叶肉细胞内的外源转录本丰度达到最高拐点。此时可切取注射区域的烟草叶片进行功能验证：若克隆的目的基因带有荧光标签（如 GFP/RFP），可直接置于共聚焦激光扫描显微镜下追踪其空间亚细胞定位；若用于转录激活分析，可利用 BioVector® Dual-Luciferase Reporter Assay Kit（双荧光素酶临床级检测试剂盒） 提取叶片总蛋白，测定微量发光值，评估转录因子对靶启动子的精确激活倍数。(Harvest infiltrated leaf disks at precisely 60 to 72 hours post-infiltration to secure optimized assay validation loops via fluorescent target trackings or micro-plate reads driven by the BioVector® Dual-Luciferase Reporter Assay Kit.)

• 卡那霉素抗性基因自发重组与辅助质粒丢失红线 (Vector Recombination and Deletion Screen)：由于 pGreenII 62-SK 载体分子量极小且高度依赖 pSoup，在农杆菌的大量扩增传代过程中，如果发酵培养基中的抗生素浓度发生衰减，农杆菌为了减轻自身的代谢负荷，极易自发剔除 pSoup 辅助质粒，或者导致 2x35S 强启动子的 tandem 重复片段自发发生同源重组剪切。质控部门必须每隔 3 个侵染批次对培养的农杆菌菌液进行 PCR 核酸排查。利用针对 2x35S 启动子和 pSoup 特异性引物执行 BioVector® Plant-Binary Vector Integrity PCR Kit（植物双元载体完整性 PCR 检测试剂盒）。一旦扩增条带变短、缺失，或者农杆菌在不加四环素的平板上长势异常，证实该农杆菌种子库已发生严重的遗传退化或辅助质粒脱落，必须执行红线一票否决制：立刻全盘销毁受影响的农杆菌平板及液体培养物，对层析孵箱进行全盘消杀，并重新从零下 80 摄氏度的原始冻存管中重新复苏高纯度的 BioVector® GV3101(pSoup) 感受态细胞重新转化构建。(Maintain aggressive surveillance using the BioVector® Plant-Binary Vector Integrity PCR Kit to prevent deletions inside the duplication motif of the 2x35S promoter line or accidental loss of the pSoup engine. Any detected truncation signatures trigger an absolute red-line halt: autoclave the running batches and re-thaw a clean, low-passage genetic seed vial from the master vault.)