pTRK892 BioVector® 乳酸菌高稳定型克隆与表达质粒 / BioVector® pTRK892 Lactococcus/Lactobacillus Shuttle Cloning Vector

BioVector® pTRK892 乳酸菌高稳定型克隆与表达质粒 / BioVector® pTRK892 Lactococcus/Lactobacillus Shuttle Cloning Vector

1 产品基本信息与转录框架 / Product Identification and Vector Architecture

• 产品名称 (Product Name)：BioVector® pTRK892 乳酸菌高稳定型克隆与表达质粒 (BioVector® pTRK892 Lactococcus/Lactobacillus Shuttle Cloning Vector)

• 产品类型 (Vector Type)：广宿主大肠杆菌-乳酸菌穿梭克隆与高稳定表达载体 (Broad-host-range E.coli-Lactic Acid Bacteria Shuttle Expression Vector)

• 克隆复制子与选择标记 (Replication Loci and Selection Markers)：

  • 大肠杆菌复制子 (Bacterial Ori - E.coli)：pMB1 ori（在常规大肠杆菌宿主中表现为中高拷贝复制 / Intermediate-high-copy replication origin inside E.coli hosts）

  • 乳酸菌复制子 (Gram-positive Ori - LAB)：pAM-beta-1 衍生型广宿主复制子（在乳酸乳球菌 Lactococcus lactis、植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum 等革兰氏阳性食品级乳酸菌中具备极高的自主复制能力与高度的遗传稳定性 / Broad-host-range gram-positive replicon ensuring robust theta-type autonomous replication and genetic fidelity in Lactic Acid Bacteria without antibiotic selective pressure.）

  • 选择性抗性标记 (Selection Marker)：Erythromycin（Ery 属性，红霉素抗性）。在宿主大肠杆菌中的工作浓度通常为 150 到 200 ug/mL；在宿主乳酸菌中的工作筛选浓度通常为 5 到 10 ug/mL。(Erythromycin resistance marker, functioning at 150 to 200 ug/mL for Escherichia coli selection cascades and 5 to 10 ug/mL for Gram-positive industrial fermentations.)

• 核心核心转录盒与多克隆位点 (Core Expression Cassette and MCS)：

  • 启动子配置 (Promoter System)：搭载了高度优化的乳酸菌内源性强启动子（如由 pTRK 谱系改良的固有型高表达启动子，或受控型可调启动子），能够驱动下游外源靶向基因在乳酸菌胞质内高丰度转录表达。(Equipped with a highly active, characterized constitutive or inducible Lactic Acid Bacteria promoter framework optimized for driving downstream biomass transcriptions.)

  • 多克隆位点 (Multiple Cloning Site - MCS)：包含了如 EcoRI、SacI、KpnI、BamHI、XbaI、SalI、PstI、SphI 和 HindIII 等一系列独特的限制性内切酶切位点，便于方向性克隆各种工业工程用酶或抗原表达基因。(Features a versatile directional insertion window maximizing versatile restrictions for down-stream gene framing.)

2 分子细胞生物学特征与工业应用价值 / Molecular Dynamics and Biotechnological Value

BioVector® pTRK892 载体是全球乳业发酵工程、益生菌药物递送系统（Live Biotherapeutic Products, LBPs）以及食品级安全表达系统（Food-grade Expression Systems）研究的核心分子工具：The BioVector® pTRK892 vector framework acts as a foundational molecular engineering layout tailored for functional dairy development, oral live biotherapeutic systems, and non-pathogenic food-grade bio-manufacturing:

广宿主普适性与稳定性机制 (Broad-Host Compatibility and Structural Stability)

许多普通的质粒在进入乳酸菌（尤其是乳杆菌）后，由于滚环复制（Rolling-circle replication）机制的影响，极易发生自发性结构重组、大片段缺失或者随细胞分裂快速丢失。BioVector® pTRK892 采用了优化的 Theta 型复制通路结构，极大降低了由于单链 DNA 中间体堆积引发的遗传漂移，即使在工业大规模无抗生素连续发酵中，质粒留存率依然显著优于传统载体。Traditional Gram-positive plasmids running rolling-circle replication modes often yield highly unstable single-stranded intermediates, triggering rapid plasmid loss or truncations inside Lactobacillus lineages. BioVector® pTRK892 implements a theta-type replication engine, minimizing operational dna stress, preserving severe plasmid retention metrics throughout antibiotic-free pilot fermentations.

核心科研与工程应用方向 (Core Downstream Applications)

• 黏膜免疫与口服疫苗递送 (Mucosal Immunization Platforms)：可用于克隆表达病原体特异性表面抗原（如病毒刺突蛋白片段、细菌毒素亚基），利用食品级干酪乳杆菌或乳酸乳球菌作为活菌载体，开发口服或鼻腔免疫的黏膜疫苗。(Used for engineering surface display or secretory pathogenic antigens inside safe strains to elicit protective intestinal mucosal immune responses.)

• 工业发酵酶与益生生化代谢工程 (Probiotic Metabolic Engineering)：用于向发酵乳杆菌中转入外源 beta-半乳糖苷酶（降低乳糖不耐受）、生物活性肽合成酶、以及特定抗氧化物酶，大幅优化发酵制品的风味与益生保健功能。(Facilitates the introduction of beta-galactosidase variants or specific bacteriocin clusters to enrich background dairy matrix bio-availabilities.)

3 宿主大肠杆菌扩增与质粒维持规范 / Bacterial Amplification and Cloning Protocols

警告 / Critical Warning在使用大肠杆菌进行质粒扩增或重组连接产物转化时，由于该载体含有表达红霉素抗性基因的革兰氏阳性特殊表达转录盒，在 E.coli 中生长时可能会对细胞造成一定的代谢毒性。必须严格限制扩增阶段的摇床温度，禁止使用 37 摄氏度高速扩增，否则极易导致大肠杆菌快速裂解或质粒拷贝数异常降低。When propagating this shuttle plasmid or ligation derivatives inside Escherichia coli competent cells, metabolic profiles tied to the Gram-positive erythromycin expression box may provoke physiological toxicity. Cultivation must be restricted to 30 degrees Celsius inside shakers; do not run at standard 37 degrees Celsius, otherwise severe host lysis or plasmid copy plunges will manifest.

选用的宿主菌株与培养基配方 / Authorized Bacterial Host and Broth Rules

• 推荐大肠杆菌宿主 (Mandatory E.coli Host)：BioVector® Top10 或 BioVector® DH10B 基因工程大肠杆菌感受态细胞（严禁使用具有高自发突变倾向的低级宿主菌 / High-efficiency cloning competent lines with compromised nuclease activity）。

• 专用扩增培养基 (Growth Medium)：BioVector® LB Liquid Medium 液体培养基（每升含 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g 氯化钠 / 10g Tryptone, 5g Yeast Extract, 10g NaCl per liter）。

• 大肠杆菌筛选选择抗性 (Antibiotic Selection in E.coli)：每毫升培养基添加 150 到 200 微克 BioVector® Erythromycin（红霉素）。由于大肠杆菌对红霉素天然敏感性较低，其工作浓度需显著高于革兰氏阳性菌。(Supplement with 150 to 200 ug/mL of BioVector® Erythromycin. E.coli features a higher natural threshold resistance against macrolides, requiring elevated screening parameters.)

• 大肠杆菌栽培控温 (Thermal Parameters - E.coli)：全程必须在 30 摄氏度下进行恒温震荡培养（180 到 200 rpm），连续过夜培养时间控制在 16 到 18 小时即可进行质粒小量或中量抽提。(The culture must be shaken at 30 degrees Celsius (180 to 200 rpm) for 16 to 18 hours to prevent deletion tracks before harvesting plasmid blocks.)

4 乳酸菌电转化与稳定株筛选规范 / Lactic Acid Bacteria Electroporation and Selection

A 阶段：受体乳酸菌（如乳酸乳球菌）电感受态细胞制备 / Phase A: Preparation of Electrocompetent LAB Cells

1. 挑取乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）单菌落接种于 BioVector® GM17 液体培养基中（含 0.5% 葡萄糖），30 摄氏度静置过夜培养。(Inoculate Lactococcus lactis into BioVector® GM17 broth and grow statically overnight at 30 degrees Celsius.)

2. 按 1比50 的比例将过夜菌液转接至新鲜的 BioVector® SGM17 专用电击增殖培养基中（内含 0.5 M 蔗糖以及 1% 到 2% 的甘氨酸 / supplemented with 0.5 M Sucrose and 1% to 2% Glycine）。甘氨酸能有效削弱乳酸菌坚固的肽聚糖细胞壁，这是后续电击转导成功的关键核心。(Glycine weakens the rigid Gram-positive peptidoglycan cell wall layout, unlocking the mandatory pathway for functional macromolecular macro-poration.)

3. 30 摄氏度静置培养至对数生长中期（OD600 达到 0.4 到 0.6 之间）。

4. 将菌液置于冰浴上冷却 15 分钟，随后在 4 摄氏度下以 3000 乘以 g 离心 10 分钟收集菌体沉淀。

5. 使用预冷的 BioVector® Electroporation Wash Buffer（含 0.5 M 蔗糖与 10% 甘油的无菌洗涤重悬液） 连续离心洗涤菌体 3 到 4 次，彻底清除残存的培养基离子，最终按 1比100 的体积浓缩重悬，分装至冰预冷的无菌电击管中备用。(Wash the cell pellet 3 to 4 times using ice-cold sterile BioVector® Electroporation Wash Buffer to exhaust lingering ionic backgrounds.)

B 阶段：电击转化与高特异性红霉素抗性株筛选 / Phase B: Electroporation and Screening

1. 取 40 微升 制备好的乳酸菌电感受态细胞，加入 1 到 2 微克 从大肠杆菌中提取纯化的高纯度 BioVector® pLenti 类似纯度的 pTRK892 质粒DNA，轻柔混匀，冰浴 5 分钟。(Combine 40 uL competent cells with 1 to 2 ug pure plasmid DNA, transfer into an ice-cold 0.2 cm electroporation cuvette.)

2. 将混合物转移至无菌的 0.2 厘米 电击杯中，设置微量电穿孔仪参数：电压设定为 2.0 到 2.5 kV，电容设定为 25 uF，电阻平行设定为 200 欧姆，启动单次电击转导。(Discharge a single electrical pulse tailored for LAB metrics: voltage set to 2.0-2.5 kV, capacitance at 25 uF, parallel resistance at 200 Ohms.)

3. 电击完成后，必须立即注入 1.0 mL 预冷的 BioVector® Recovery Media 复苏培养基（含 0.5 M 蔗糖的丰富 GM17 培养基），轻柔混匀后转移至无菌离心管中。(Immediately rescue the shocked suspension with 1.0 mL of ice-cold BioVector® Recovery Media to restore cellular turgor pressure.)

4. 置于 30 摄氏度恒温孵箱中绝对静置复苏培养 1.5 到 2 小时，让红霉素耐药性表达盒充分转录翻译出足量的功能蛋白。(Incubate statically at 30 degrees Celsius for 1.5 to 2 hours, allowing full synthesis of the erythromycin resistance factor.)

5. 将复苏菌液低速离心浓缩，全量涂布于含有 5 到 10 ug/mL BioVector® Erythromycin（红霉素）的 GM17 选择性琼脂固体平板上。(Plate the concentrated recovery broth onto BioVector® GM17 selection plates fortified with 5 to 10 ug/mL Erythromycin.)

6. 将平板置于 30 摄氏度恒温培养箱中静置培养 24 到 48 小时，长出的圆形光滑、带红霉素抗性的单菌落即为成功转导了该乳酸菌表达载体的工程突变株。

5 工程菌长期甘油保存与质控红线 / Banking and Functional Quality Assays

• 工程乳酸菌长期保存 (Glycerol Archiving)：挑取验证正确的红霉素抗性乳酸菌单菌落，在含有 5 ug/mL 红霉素的液体培养基中静置栽培至对数生长旺盛期。吸取 700 微升 菌液加入 300 微升 无菌的 BioVector® Cryo-Stabilizer 纯甘油补剂 中（最终甘油浓度为 30%），彻底颠倒混匀后立刻投入零下 80 摄氏度超低温冰箱中，可稳定冻存保存 3 年以上。(Prepare glycerol archives by adding 700 uL mid-log phase bacterial suspension to 300 uL sterile BioVector® Cryo-Stabilizer glycerol mixture, freeze and archive at minus 80 degrees Celsius.)

• 目的基因丢失与载体脱落质控红线 / Vector Integrity Quality Check：虽然 pTRK892 具备 Theta 型复制的高稳定性，但在进行多轮大规模工业传代或高密度连续发酵时，随着生物量的扩增，仍可能发生由于外源蛋白过度表达引发的反向进化选择，导致部分菌株自发剪切外源片段或发生载体脱落。严格质控表现为：每隔 5 个发酵批次，或连续传代超过 20 代时，必须抽取发酵液进行单菌落分离，随机挑取 20 个 菌落分别接种在含抗生素与不含抗生素的平板上，验证质控留存率。同时，提取菌体总质粒进行 PCR 扩增或多位点限制性内切酶切验证，如果发现目的基因扩增条带变短、缺失，或者不含抗生素平板上的菌落总数与含抗生素平板出现数量级偏差（质粒留存率低于 90%），证实该生产批次菌种已发生严重的功能退化或严重载体丢失。必须全盘销毁当前发酵罐中的所有活菌体，并重新从零下 80 摄氏度的超低代次种子库中复苏纯系单菌落进行功能恢复生产。(Over extended operational multi-batch fermentation cycles, excessive protein production can prompt reverse evolutionary selection, driving cassette dropouts. To enforce strict quality control, draw fresh broth samples every 5 production lots; compute plasmid retention values across cross-antibiotic plating assays. If the calculated plasmid legacy drops below 90% or restriction footprints shrink, the active operational run is compromised; purge current bio-reactors immediately and re-thaw a low-passage master banking vial from the deep freeze vault.)

BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

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