BioVector® cES2 (CVCL_JK98) Canine Embryonic Stem Cell Line / cES2 (CVCL_JK98) 犬胚胎干细胞株

一 产品基本信息与细胞生物学背景

• 细胞名称：cES2。

• Cellosaurus 检索号：CVCL_JK98。

• 物种与品种来源：犬（Canis lupus familiaris），衍生自标准实验模式犬种——比格犬（Beagle）。

• 发育阶段与组织源起：源自发情交配后第 11-16 天的犬类囊胚（Blastocyst stage）的内细胞群（Inner Cell Mass, ICM）。

• 细胞系建立背景（cES1 的同源独立姐妹亚系）：

  cES2 细胞株与经典的 cES1（CVCL_JK97）株共同由日本动物繁殖学与兽医学再生医学专家 Hatoya（鸠谷雄）及 Inaba（稻叶俊夫）教授团队于 2006 年自同一个实验批次中独立分离克隆并成功建立。

  作为 cES1 质控阵列中的平行独立亚系（Sister cell line），cES2 的建立进一步确证了犬类胚胎干细胞体外分离技术的重复性与生物学稳态。由于在消化解离时发现犬早期胚胎对传统的胶原酶高度敏感易导致自发分化，该团队通过改用纯机械机械分割法（Mechanical disaggregation），成功维持了 cES2 在体外长期连续传代培养中的不分化状态。作为大动物模式干细胞的核心底盘，cES2 广泛用于印证伴侣动物（宠物犬）在组织工程、器官发育及重大遗传缺陷修复中的临床转化安全性。

• 核心表型与细胞生物学特征：

  • 形态学表现：依赖灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）滋养层或重组基底膜基质贴壁生长。在显微镜下，cES2 表现为高度隆起、致密、折光度极强的扁平鸟巢状或海岛状干细胞克隆团（Colony formation）。细胞间界限在未分化状态下极其模糊，单细胞表现出典型的高核质比和清晰的多核仁结构。

  • 多能性生物标志物（Pluripotency Markers）：经系统免疫荧光与定量 PCR 测定，cES2 持续保持对关键全能性转录因子 Oct-4 (Pou5f1) 的强阳性转录，同时表现出强烈的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）催化活性 以及阶段特异性胚胎抗原-1（SSEA-1）的阳性表达。

• 生物安全级别：1级（BSL-1）。

二 核心科研价值与兽医再生医学转化应用

cES2 与 cES1 在科研和兽医医学中形成了完美的互补验证矩阵：

1. 对比验证与多克隆株系排除异质性（Clonal Heterogeneity）研究：

   在干细胞生物学中，单一克隆系往往存在随机的表观遗传修饰差异或质控偏差。通过引入 cES2 与 cES1 进行平行对照实验，科研人员能够系统性地排除因个体克隆差异导致的假阳性结果，从而更精准地定义犬类全能性维持的核心信号通路（如 LIF/STAT3 轴与 BMP 抑制轴的协同机制）。

2. 三胚层体外自发与定向分化研究（拟胚体 EB 诱导）：

   cES2 在悬浮培养条件下具有极强的多细胞聚集能力，能形成完美的拟胚体（Embryoid Bodies, EBs），并在延长培养后进一步发育为中空的囊泡状拟胚体（Cystic EBs）。当将这些 EB 重新贴壁于培养皿时，它能够自发或靶向分化为神经元样细胞（外胚层）、上皮样细胞（内胚层）、成纤维细胞样以及黑色素细胞样细胞（中胚层）。这为临床上修复宠物犬由外部创伤、退行性变引起的各种神经坏死和肌肉骨骼缺损提供了标准的分化底盘。

3. 宠物犬临床重大遗传性及自发性肿瘤疾病模型构建：

   比格犬及特定品种宠物犬在临床上高发各类自发性肿瘤、心脏瓣膜疾病以及退行性关节炎。cES2 可作为优异的基因编辑（CRISPR-Cas9）受体底盘，用于在体外精准敲入或敲除特定致病位点，在干细胞阶段直接模拟犬类先天性遗传缺陷，为兽医临床精准医疗和小分子药物筛选建立高保真细胞靶盘。

三 实验室干细胞复苏、多能性维持培养、机械/酶学传代标准步骤

极其重要的操作警告：与 cES1 类似，cES2（CVCL_JK98）对常规的强烈消化液（如含有高浓度大肠杆菌来源的普通 Trypsin-EDTA）极其脆弱，过度消化极易引发细胞大面积自发分化或触发失巢凋亡（Anoikis）。日常操作必须遵循“保留微小细胞团”的准则，绝对禁止将细胞反复吹打成完全独立的单细胞悬液！

1. 专用培养基、饲养层基质与环境参数

• 饲养层体系（经典黄金推荐）：提前一天在培养皿或 T25 瓶中接种经丝裂霉素 C（Mitomycin C）或射线辐照灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），确保其贴壁并形成汇合度为 100% 的连续滋养单层。

• 完全胚胎干细胞培养基（cESC Complete Medium）典型配方：

  • KnockOut DMEM（高级低渗透压、针对干细胞优化的基底培养基）

  • 加 15% - 20% 优质干细胞级胎牛血清（ESC-Qualified FBS）（或使用 15% KnockOut Serum Replacement, KSR 替代物进行无血清滋养）

  • 加 1% 必需氨基酸（NEAA）

  • 加 1% GlutaMAX（或高级 L-谷氨酰胺）

  • 加 0.1 mM $\beta$-巯基乙醇（$\beta$-mercaptoethanol，防止胞内氧化，维持未分化状态的核心添加物）

  • 加 10 - 20 ng/mL 重组白血病抑制因子（Recombinant LIF）（必要时可额外补充 20 ng/mL bFGF）

  • 加 1% 青霉素-链霉素双抗。

• 物理生长环境：37 摄氏度，恒温、饱和高湿度，含 5% 二氧化碳（$CO_2$） 的无菌孵箱。

2. 冷冻干细胞的复苏与柔和接种步序

1. 提前准备好带有贴壁 MEF 饲养层、含有 4 mL 预热至 37 ℃ 完全 cESC 培养基的 T25 培养瓶。

2. 从液氮罐中取出 cES2 冻存管，迅速全量浸入 37 ℃ 恒温水浴箱中快速晃动以期在 1 分钟内令管内冰块完全融化。

3. 用 75% 酒精喷洒冻存管外壁进行严密消毒，移入生物安全柜。

4. 用移液枪将融化的细胞悬液极其缓慢地（呈逐滴状，每滴间隔数秒）加入到盛有 5 mL 预热完全培养基的 15 mL 离心管中。由于胚胎干细胞膜对渗透压剧烈波动的耐受力极差，此处的慢速滴加对维持复苏存活率起决定性作用。

5. 以 800 - 1000 rpm（约 150 - 200 g）进行温和低速离心 5 分钟。

6. 小心抽干含有 DMSO 的上清液，加入 1 - 2 mL 新鲜的完全培养基。

7. 核心手法控制：用 P1000 移液枪轻轻吸起并吐出 2 次即可。绝对严禁高频率或强烈吹打沉淀！ 必须使细胞保持为包含数十个细胞的微小团块（Small clumps）状态。

8. 将带有微细胞团的悬液接种至铺有饲养层的培养瓶中，轻柔“十字形”晃匀，置于 37 ℃、5% $CO_2$ 孵箱中静置暗培养。

9. 复苏 24 小时后，进行一次全量换液，清除未贴壁的碎屑与死细胞。

3. 日常贴壁克隆群的传代操作（温和酶学片段化或机械切割传代）

• 传代时机：当 cES2 的克隆团覆盖整个视野的 70% - 80%，克隆体积巨大、内部局部变厚，但尚未发生边缘泛黄松散或中心大面积变黑分化时，必须立刻进行 subculture 传代（通常每 4 - 6 天传代一次）。

• 操作流程：

  1. 吸除旧培养基，用无钙镁离子的无菌 PBS 缓冲液轻轻漂洗 1-2 次。

  2. 加入适量温和的干细胞专用解离酶（强烈推荐 StemPro Accutase 细胞解离液、或 1× 胶原酶 IV Collagenase IV，尽量不使用普通胰蛋白酶）覆盖细胞表面。

  3. 放入 37 ℃ 孵箱中温和孵育 2 - 4 分钟，每隔一分钟置于显微镜下动态观察。

  4. 终止解离指征：一旦显微镜下看到高度隆起的克隆团边缘收缩变圆、开始整体与底板发生松动，但克隆团尚未完全碎裂成散点状单细胞时，必须立刻加入 2 倍体积的含血清完全培养基终止消化。

  5. 用移液管轻柔冲洗瓶壁将克隆团洗脱下来，收集至 15 mL 离心管。

  6. 片段化控制（Crucial）：用移液枪极其轻柔地吹打 1 - 2 次，将大克隆块剪切为包含 50 - 100 个细胞的微小细胞片段（Small clumps）。

  7. 1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，用新鲜的完全培养基重悬这些克隆片段。

  8. 按照 1:3 至 1:4 的传代比例接种到长有全新 MEF 饲养层的器皿中。旋松瓶盖，37 ℃ 稳定静置培养。传代后 48 小时内应严禁反复挪动或震动培养瓶，给干细胞片段提供绝对安静的物理环境以顺利完成锚定贴壁。

4. 显微镜下多能性维持与分化辨识（生命科学质控金标准）

• 标杆未分化状态（未分化）：

  cES2 展现出边缘极为清晰、陡峭且平滑的扁平“海岛状”或“鸟巢状”多细胞聚集克隆。克隆内部细胞排列严密紧致，折光性高度均匀统一。

• 自发分化状态（已分化，需淘汰）：

  当 LIF 浓度降解失效、环境温度出现波动或消化过频被打成单细胞时，克隆团边缘将开始“松散决口”。细胞从边缘向外逸出拉长，呈现出扁平、拉长、铺开的成纤维细胞样或纺锤形、上皮细胞样形态，克隆整体立体感消失，AP 染色随之转阴。

  处理对策：若在传代前发现局部自发分化，必须在显微镜下操作，使用无菌巴氏吸管尖端或专用微型干细胞刮刀，将形状不规则、已经铺开分化的杂质区域机械式刮除并吸走（Mechanical picking out），只挑选最纯正、规则的圆形未分化克隆片段进行传代扩增，以锁牢 cES2 的纯正多能性表型。

5. 细胞长期保存标准

• 冷冻保存液配方：90% 优质干细胞完全培养基 加 10% 最高分析级二甲基亚砜（DMSO）；或直接使用商用干细胞无血清保护型冻存液（如 CryoStor CS10）。

• 梯度冷冻规范：

  1. 冻存前确保 cES2 细胞未分化率 $\gt 95\%$，收集经温和酶解剪切成的微小克隆片段（严禁冻存单细胞）。

  2. 离心收集沉淀，用预冷的冻存液重悬，分装入无菌专用冻存管，保持每毫升含有 3,000,000 - 5,000,000 活细胞数的高密度状态。

  3. 立刻置于标准程序降温盒（Mr. Frosty）中，投入 -80 ℃ 超低温冰箱中慢速梯度降温过夜。

  4. 24 小时内，以极快的速度将冻存管转移并锁死在液氮罐（-196 ℃）中长期存放。严禁在 -80 ℃ 冰箱长期搁置，以防干细胞的多能性分子纽带和比格犬染色体组的遗传稳定性发生退化。

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