BioVector® cES1 (CVCL_JK97) Canine Embryonic Stem Cell Line / cES1 (CVCL_JK97) 犬胚胎干细胞株

一 产品基本信息与细胞生物学背景

• 细胞名称：cES1。

• Cellosaurus 检索号：CVCL_JK97。

• 物种与品种来源：犬（Canis lupus familiaris），更精确地源自经典的实验模式犬种——比格犬（Beagle）。

• 发育阶段与组织源起：源自犬类的囊胚期（Blastocyst stage）的内细胞群（Inner Cell Mass, ICM）。

• 细胞系建立背景（犬类再生医学的重要底盘）：

  cES1 细胞系是由 Hatoya（鸠谷雄等）及 Inaba（稻叶俊夫）等著名的日本动物繁殖学与兽医再生医学研究团队于 2006 年成功分离并鉴定的犬胚胎干细胞（Canine Embryonic Stem Cells, cESCs）。

  由于犬类在解剖学、生理学、免疫系统构造以及自发性肿瘤和遗传病谱系上与人类表现出极高的相似性，它们一直被视为评估人类干细胞临床应用安全性与有效性最关键的非中胚层大动物模型。cES1 细胞株的成功建立，攻克了犬类早期胚胎体外消化、内细胞群（ICM）机械免疫剥离以及体外维持干细胞多能性（Pluripotency）不分化的核心瓶颈，成为全球研究犬类组织器官再生、伴侣动物现代兽医诊断以及基础哺乳动物早期发育生物学的经典细胞株。

• 核心表型与细胞生物学特征：

  • 形态学表现：依赖饲养层（Feeder cells，如小鼠胚胎成纤维细胞 MEF）或特定的多能性维持基质贴壁生长。在显微镜下，cES1 细胞表现为极其典型的、高度密集的克隆样扁平鸟巢状生长（Colony formation）。克隆团边缘极其清晰、平滑，单个细胞体积微小、胞核巨大且核仁清晰，呈现高核质比（High nuclear-to-cytoplasmic ratio）。

  • 全能性生化标志（Pluripotency Markers）：经分子生物学验证，cES1 细胞能持续呈高度阳性表达经典的胚胎干细胞核心转录因子：Oct4（Pou5f1）、Nanog、Sox2，并且碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）染色呈现极强的特异性深蓝紫色阳性。它还表达特定阶段胚胎抗原（如 SSEA-3、SSEA-4）以及高分子量糖蛋白（TRA-1-60、TRA-1-81）。

• 生物安全级别：1级（BSL-1）。

二 核心科研价值与兽医再生医学转化应用

cES1 细胞株在伴侣动物高端医疗、遗传病模拟和药理学评估中发挥着至关重要的作用：

1. 犬类三胚层体外定向分化与器官类器官（Organoids）构建：

   cES1 具有完美的体外多能分化潜能。在改变培养基细胞因子配方（如撤去多能性维持因子或进行悬浮拟胚体 EB 培养）后，该细胞能够自发或定向分化为内胚层（如肝样细胞）、中胚层（如心肌细胞、成骨细胞）和外胚层（如神经元、胶质细胞）。这是构建犬类各种靶向类器官模型、用于修复宠物临床上诸如犬脊髓损伤、严重心肌缺血或糖尿病造成的胰岛损伤的底层细胞工厂。

2. 伴侣动物全基因组多能性调控与表观遗传学解析：

   用于解构犬类在早期胚胎发育阶段，染色质重塑（Chromatin remodeling）、DNA甲基化修饰以及 X 染色体失活（X-chromosome inactivation）的独特表观遗传时空动态。这对于提高克隆犬（Somatic cell nuclear transfer, SNT）的存活率与质量至关重要。

3. 兽医临床创新药物安全性与小分子毒理高通量体外筛查：

   在开发宠物犬专用新型小分子靶向药物、抗生素、癌症化疗药和各种宠物疫苗时，直接在体外利用 cES1 分化的多功能细胞株代替活体比格犬进行高通量的急性细胞毒性（Cytotoxicity）、遗传毒性和潜在致畸性（Teratogenicity）评估，完美践行国际实验动物的 3R 原则（减少、替代、优化）。

三 实验室干细胞复苏、多能性维持培养、机械/酶学传代标准步骤

极其重要的操作警告：犬类胚胎干细胞（cES1）具有极高的自发分化（Spontaneous differentiation）倾向。日常维护的关键是严密监控显微镜下的克隆边缘、维持足量的维持因子（如 LIF）和优质的基质/饲养层，日常操作必须极其轻柔，严禁将克隆团彻底吹打成孤立的单个细胞，否则会导致细胞灾难性的分化或凋亡！

1. 专用培养基、饲养层基质与环境参数

• 饲养层依赖或无饲养层基质准备：

  • 饲养层体系（推荐经典法）：提前一天在 T25 培养瓶中铺好经丝裂霉素 C（Mitomycin C）或射线灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为饲养层，待其贴壁汇合形成致密致密的滋养单层。

  • 无饲养层体系：必须使用高级细胞外基质（如高级可溶性基底膜基质 Matrigel 或人源重组多粘连蛋白 Vitronectin）提前包被培养器皿。

• 完全胚胎干细胞培养基（cESC Complete Medium）典型配方：

  • KnockOut DMEM（高级低渗透压主干培养基）或 DMEM/F12 基底

  • 加 15% - 20% 优质干细胞专用胎牛血清（ESC-qualified FBS） 或 15% KnockOut Serum Replacement (KSR，外源血清替代物)

  • 加 1% 必需氨基酸（NEAA）

  • 加 1% L-谷氨酰胺（或 GlutaMAX）

  • 加 0.1 mM $\beta$- mercaptoethanol（$\beta$-巯基乙醇，核心抗氧化与维持多能性因子）

  • 加 10 - 20 ng/mL 人源/犬源重组白血病抑制因子（Recombinant LIF）（部分亚型研究可能需要额外添加碱性成纤维细胞生长因子 bFGF 20 ng/mL，依具体传代特性微调，主要由 LIF 维持其原始态多能性）

  • 加 1% 青霉素-链霉素双抗。

• 生长物理常数：37 摄氏度，含 5% 二氧化碳（$CO_2$） 的恒温高湿度饱和孵箱。

2. 冷冻干细胞的复苏与点阵式接种

1. 提前确认准备好长有灭活 MEF 饲养层、含有 4 mL 预热完全 cESC 培养基的 T25 培养瓶。

2. 从液氮罐中取出 cES1 冻存管，立刻全量浸入 37 ℃ 恒温水浴箱中快速、剧烈摇晃解冻，在 1 分钟左右令其迅速融化。

3. 喷洒 75% 酒精消毒外壁，移入生物安全柜。

4. 用移液枪将细胞悬液极其缓慢（按滴）加入到盛有 5 mL 预热完全培养基的 15 mL 离心管中（干细胞对渗透压剧变极其敏感，滴加动作必须维持 1-2 分钟缓慢进行）。

5. 以 800 - 1000 rpm（约 150 - 200 g）温和离心 5 分钟，最大化减少对干细胞膜的剪切力。

6. 极其小心地抽干含有 DMSO 的上清液。加入 1-2 mL 新鲜 cESC 完全培养基。

7. 关键手法：使用 P1000 移液枪轻轻吸起并吐出 2 - 3 次即可。千万不要将细胞沉淀彻底吹成单细胞单悬液！ 必须保留数个细胞聚集成的小型微细胞团（Cell clumps）。

8. 将带有微型细胞团的悬液均匀接种到长有 MEF 的培养瓶中，轻柔十字摇匀，放入 37 ℃、5% $CO_2$ 孵箱中。

9. 24 小时后必须全量更换新鲜培养基，洗去死细胞和残余物质，继续静置暗培养。

3. 日常贴壁常规克隆群传代操作（机械片段化与温和酶解）

• 传代时机：当扁平的“鸟巢状”大克隆团融合汇合、克隆内部开始变得过厚、或者克隆团之间开始相互接触，且克隆中心尚未发生自发分化变黑（汇合度约占视野的 70% - 80% 时，通常 4 - 6 天）必须立刻传代。

• 操作流程（推荐温和酶解片段化法）：

  1. 吸除旧培养基，使用无菌的无钙镁离子 PBS 缓冲液轻轻漂洗细胞表面 1-2 次。

  2. 加入适量极为温和的干细胞解离酶（如 StemPro Accutase、或者 1× 胶原酶 IV Collagenase IV，尽量避免使用高强度的普通大肠杆菌来源 Trypsin-EDTA）。

  3. 置于 37 ℃ 孵箱中温和孵育 2 - 5 分钟。密切在显微镜下动态观察。

  4. 终止指征：当观察到扁平克隆团的边缘开始出现向内收缩、变圆，但整个克隆团还没有完全碎裂脱落成单细胞时，立刻加入 2 倍体积的含血清完全培养基终止消化。

  5. 用移液管轻柔地冲洗瓶壁，将开始松动的克隆团洗脱下来，收集至离心管。

  6. 控制吹打力度：轻柔吹打 2 - 3 次，将其剪切成包含几十个到上百个细胞的微小片段（Small clumps of 50-100 cells）。

  7. 1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬这些克隆片段。

  8. 按照 1 比 3 至 1 比 4 的常规稀释比例接种至铺有全新 MEF 饲养层的培养器皿中，旋松瓶盖，37 ℃ 稳定静置培养，传代后 48 小时内尽量避免反复翻动和震动摇晃摇摆，以便细胞片段完美锚定贴壁。

4. 显微镜下多能性状态与自发分化（质量核心控制点）

• 完美的未分化状态（标杆未分化）：

  cES1 克隆群边缘锐利光滑，呈致密的二维/微三维扁平“海岛状”或“鸟巢状”。克隆内部细胞排列高度致密，看不出单个细胞的独特边界，折光度在显微镜下非常均一。

• 分化状态提示（必须淘汰或手工刮除的劣质状态）：

  如果培养基内的 LIF 浓度失效、或者消化过度吹成了单个细胞，克隆团边缘将开始泛黄、变得粗糙不规则，细胞从边缘散落逸出，呈现出拉长的成纤维细胞样、或者完全铺开的上皮细胞样（Flattened epithelial-like）形态。克隆中心也可能隆起变黑，AP 染色转阴。一旦出现这种情况，需要在传代前，在显微镜下用无菌巴氏吸管尖端或专用干细胞刮刀，将变异分化的区域手工机械刮除并吸走（Mechanical picking out），只保留最纯净的圆形未分化克隆进行传代，以确保该干细胞库纯正的宿主多能性。

5. 细胞长期保存标准

• 冷冻保存液配方：90% 优质胚胎干细胞完全培养基 加 10% 分析级二甲基亚砜（DMSO）；或者采用更高级的干细胞无血清高存活冻存液（如 CryoStor CS10）。

• 梯度冷冻规范：

  1. 收集处于生长最旺盛的中期、未分化率 $\gt 95\%$ 的 cES1 克隆群片段（维持微小细胞团状态，严禁将其打成单细胞）。

  2. 温和离心沉淀后，用预冷的冻存液重悬，迅速分装入专用冻存管。

  3. 立即装入标准程序降温盒中，投入 -80 ℃ 冰箱中缓慢梯度降温过夜。

  4. 24 小时内，极其迅速地将冻存管转移入液氮罐（-196 ℃）中锁死长期存放。胚胎干细胞对温度波动极其敏感，在液氮中才能确保其多能性标志物与犬类染色体组的长期遗传稳定。

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