CHO DHFR- cell line, ATCC CRL-9096 BioVector NTCC中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心

CHO DHFR- cell line, ATCC CRL-9096

该细胞为二氢叶酸还原酶缺陷细胞。在没有HT（次黄嘌呤-胸腺嘧啶）时细胞会死亡。细胞培液中加氨甲喋呤可以防止对药物低抗性的回变细胞的生长。

细胞特性

1）来源：中国仓鼠

2）形态：贴壁生长时，呈上皮细胞样；悬浮生长时，呈圆球形。

3）含量：>1x10⁶ 个/mL

4）污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

运输和保存：使用含有优质胎牛血清的2ml冻存管发送存活细胞。收到细胞后，可在1000RPM，常温条件下，离心5min后，于洁净操作台弃去上清，加入推荐使用的培养基后转移至250px培养皿或者T75培养瓶中培养，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：（此细胞比较难养，请严格遵循培养条件）

1）准备IMDM培养基(GIBCO,货号12200036)，90%；优质胎牛血清，10%，添加0.05mM次黄嘌呤，0.016mM胸腺嘧啶，100nM氨甲喋呤。

用于表达蛋白时，也可使用悬浮培养基，使细胞悬浮生长。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM条件下离心4分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO后进行冻存。

IMDM培养基(GIBCO,货号12200036)，90%；优质胎牛血清，10%，添加0.05mM次黄嘌呤，0.016mM胸腺嘧啶，100nM氨甲喋呤

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