pIB-YN155双分子荧光互补载体 BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心

pIB-YN155双分子荧光互补载体

目前可以用于BiFC技术的荧光蛋白有YFP，GFP，BFP、CFP、Venus和mRFP等，本次介绍YFP和Venus荧光蛋白交叉的系统，即YN155 (YFP的第1-155位氨基酸，其中第YFP的第65位氨基酸由F突变为L，该点突变促进荧光蛋白的成熟)和VC156 (Venus的第156-239位氨基酸)配合使用的系统。该系统降低了假阳性和假阴性线性现象。

　　载体信息

　　该系统包含两个载体，即pIB-YN155 (载体示意图，如图2所示)和pIB-VC156 (载体示意图，如图3所示)，均由pIB-V5/His载体(载体示意图，如图4所示)改造而来。

pIB-YN155载体示意图

图2 pIB-YN155载体示意图

pIB-VC156载体示意图

图3 pIB-VC156载体示意图

pIB-V5/His载体示意图

图4 pIB-V5/His载体示意图

　　重组载体的构建

　　仅需要将待筛选的基因克隆到pIB-YN155和pIB-VC156载体上即可。严格意义上，每个基因需要同时构建到上述两个载体上。但是若只构建到一个载体上，就足以检测到互补荧光的产生，则可以不用构建到另一个载体上。

　　克隆载体时候，要注意使用的酶切位点，确保插入的目基因与后面的YN155或者VC156的ORF对框，确保融合蛋白的正确翻译。

　　共转染至同一细胞内，用荧光显微镜观察荧光互补结果。

　　注意：本实验需要设置阴性对照。即用pIB-YN155和pIB-nVC156 (VC156的N端带有atg，可以单独表VC156蛋白)。利用荧光显微镜观察时，需要调节荧光强度，在阴性对照组无荧光信号的情况下，观察实验组的荧光信号。

　　BiFC优缺点

　　BiFC优点：

　　灵活：既能够用于体内相互作用的研究，也能够用于体外相互作用的研究；

　　快速直观：能够在显微镜下直接观察到相互作用结果；

　　适用性广：BiFC系统已经被成功应用于动物，植物，真菌和细菌等不同的宿主细胞中；

　　背景干净，灵敏度高：验证结果只需检测荧光的有无，背景干净，灵敏度高；

　　能够检测弱相互作用及瞬时相互作用；

　　对仪器要求低，成本可控，数据处理相对简单；

　　BiFC缺点

　　对温度敏感：温度高时片段间不易互补形成完整的荧光蛋白，这会对研究细胞在生理条件下的相互作用带来负面影响（目前，只有基于venus、citrine和cerulean的BiFC系统可以在生理温度条件下实现片段互补）；

　　信息滞后，无法随时观察：BiFC系统想要检测到荧光，需要经过两个荧光蛋白片段互补重新形成完整的活性蛋白，以及荧光蛋白自体催化两个过程，该过程往往需要几分钟到几小时，因此观察荧光信号滞后于蛋白质的相互作用过程，不能实时地观察相互作用过程；

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