MaV203 Yeast strain/Competent cells酵母菌株/感受态细胞 BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心

MaV203 Yeast strain/Competent cells酵母菌株/感受态细胞

MATa型，利用酵母体内重组酶构建质粒的菌株.

产品规格

BioVector's MaV203 Competent Cells:                                        100μl/支            保存： -80℃（3个月）


BioVector's pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl               保存：-80℃（12个月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12个月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12个月）


基因型

MATα, leu2-3,112; trp1-901; his3∆200; ade2-101; cyh2R; can1R; gal4∆; gal80∆; GAL1::lacZ; HIS3UASGAL1:: HIS3 LYS2; SPAL10 UASGAL1::URA3





产品说明

BioVector's MaV203 菌株是利用酵母体内重组酶构建质粒的菌株，MATa型，可直接转化线性化质粒和基因片段；可以用于筛选标记为TRP，LEU，HIS，ADE的酵母质粒的转化。BioVector's MaV203 感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，BioVector's pGADT7质粒检测转化效率>106 cfu/μg DNA。






● PCR引物设计方法（例：BioVector's PGADT7质粒Ecor1/Bamh1酶切线性化质粒）

                       30-nt 同源序列               上游引物

5` --GAT  TAC  GCC  ATA  TGG  CCA  TGG  AGG  CCA  GTG   Gene specific sequences---3`                                                    质粒序列



5` --GAT  TAC  GCC  ATA  TGG  CCA  TGG  AGG  CCA  GTG                                   GATCCAA  CGA  GCT  CGA  GCT  GCA  GAT  GAA  TCG  TAG--3`

3` --CTA  ATG  CGG  TAT  ACC  GGT  ACC  TCC  GGT  CACTTAA                                    GTT  GCT  CGA  GCT  CGA  CGT  CTA  CTT  AGC  ATC---5`



                                                                         3`---Gene specific sequences   GTT  GCT  CGA  GCT  CGA  CGT  CTA  CTT  AGC  ATC---5`



质粒序列                                                                     下游引物               30-nt 同源序列


操作方法

1. 取100 µl冰上融化的BioVector's MaV203 感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100℃，2 min，快速冰浴，重复一次) 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

2. 将离心管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。

4. ddH2O 50 µl重悬，涂相应的SD-/氨基酸缺陷型板，29℃培养48-96 h。

5. 平板长出的菌落做菌落PCR（为提高成功率，菌落PCR产物最好控制在300-500bp），PCR正确的菌落接菌提质粒，酵母提取的质粒转化高效率的商业化大肠杆菌化学感受态（比如DH5a，TOP10等），再从大肠杆菌中提质粒酶切或测序鉴定，鉴定正确的质粒放-20度可长期保存。




注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. BioVector's MaV203 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。

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