LncRNA长链非编码RNA研究方法及相关载体-BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

LncRNA长链非编码RNA研究介绍

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长链非编码核糖核酸[编辑] 长链非编码核糖核酸（英語：long non-coding RNAs，简称为lncRNA）指的是长于200核苷酸的不编码蛋白质的转录物。目前，lncRNA在癌症疾病方面的研究已逐渐深入，lncRNA的突变或失调与癌细胞的发生密切相关，广大学者通多方面的研究来解释两者之间的关系，为疾病的诊断和潜在的药物靶点提供了，新型靶向治疗方案。
一、lncRNA的特点
（1）长度大于200nt的非编码RNA，部分lncRNA含有polyA尾巴；
（2）部分lncRNA可与核糖体结合，但没有或只有较弱的蛋白编码能力；
（3）相对mRNA，lncRNA的保守性较低；
（4）lncRNA的表达具有组织特异性以及时间特性。
二、lncRNA的功能
lncRNA通过折叠形成一定的空间结构与多种蛋白互作，也可通过碱基互补配对与其它核酸进行识别，这种识别又可将蛋白引导至特定序列位点，使得lncRNA在发育和癌症中的功能发挥途径更加丰富。
LncRNA参与基因的表达调控，可从表观修饰水平，转录水平和转录后水平发挥功能，主要的方式如下:
（1）结合转录因子，干扰其与promoter结合，从而调控转录；
（2）吸附miRNA，抑制其与mRNA结合，使得mRNA免于降解；
（3）作为蛋白互作的桥梁，影响蛋白多聚物的形成，调控蛋白活性；
（4）与mRNA配对结合，影响mRNA的稳定性。
三、lncRNA序列的查找
通过NCBI网站可查找目的lncRNA的序列，具体方法如下：NCBI-Gene-输入基因名称-Search-选择对应物种基因-点击进去-往下拖，选择NR编号，该序列即为lncRNA全长。
四、相关质粒构建及实验分析
（1）lncRNA的过表达
①普通表达载体：选用任何真核表达载体既可，如pCDNA3.1(+)，pECMV-EGFP-MCS等哺乳细胞载体。将目的lncRNA基因构建到目的载体中，并转染细胞（如人293T细胞），通过药性筛选以及传代筛选，得到稳定的的细胞株系；提取稳定细胞株的总RNA，反转录成cDNA，以其为模板，进行实时荧光定量PCR检测其相对表达量；
②慢病毒表达载体：选用任何可用于慢病毒表达的载体既可，如表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro，pLVX-Puro等，辅助包装质粒psPAX2，pRSV-Rev，pLP1，pLP2，pLP-VSVG等。将目的lncRNA基因构建到目的载体中，与辅助包装质粒共转染到细胞中（如人293T细胞），培养一段时间后，检测病毒滴度，一般通过荧光蛋白表达情况计算慢病毒滴度；并用抗生素进行筛选稳定细胞株，通过显微镜观察绿色荧光，获得慢病毒感染的稳定细胞株，并进行实时荧光定量PCR检测其相对表达量。

（2）lncRNA的亚细胞定位：构建荧光蛋白融合表达载体，如pEGFP-C1，pmCherry-C1等，通过FISH（Fluorescence in Situ Hybridization）验证其亚细胞定位。

（3）lncRNA的干扰表达：慢病毒干扰载体pLKO.1-EGFP，pLKO.1，pLVshRNA-EGFP(2A)Puro等，及辅助包装质粒psPAX2，pRSV-Rev，pLP1，p0265/pLP2，pLP-VSVG等。根据NCBI上的lncRNA序列设计干扰靶点，构建带目的序列的慢病毒干扰载体，后续转染质粒方法和病毒滴度检测方法同慢病毒表达载体中的表达检测。此干扰表达载体的构建，需根据（2）中的定位结果进行选择合适的方法，一般RNAi只有在胞浆中才能发挥作用，而在细胞核中的无法被干扰，而目前研究的大多数lncRNA都是胞浆内的功能验证，细胞核内目前鲜见有报道。

（4）lncRNA与miRNA的相互作用：通过在线网站预测目的lncRNA与目的miRNA之间可能的结合位点，通过对靶位点的突变，构建荧光素酶报告载体pmirGLO，将目标序列构建到fluc的3UTR区，与miRNA的mimics或NC mimics（一个是诱导剂一个是抑制剂）共转染细胞中（如人293T细胞），设置对照组不加任何miRNA试剂和无目标序列的空载体，通过荧光值的变化来验证是否与靶位点结合从而调控基因的表达。

（5）lncRNA与蛋白的互作验证：通过网站来预测目的lncRNA可能互作的靶向蛋白及相关互作蛋白，或通过高通量测序结果，挖掘其中的lncRNA与mRNA的差异变化，进而筛选兴趣蛋白。根据此预测或测序分析结果，构建相关质粒：lncRNA和靶蛋白的慢病毒过表达载体及干扰表达载体，分别进行细胞实验：通过RNA pull-down实验（lncRNA已知，靶蛋白未知，实验对象蛋白仅通过网站预测），用T7 RNA聚合酶标记lncRNA实验组，与抗生蛋白链菌素磁珠混合过夜，富集的蛋白通过SDS-PAGE进行分离，然后选择特异性蛋白条带进行质谱检测，或通过RT-qPCR靶向蛋白的相对表达量，分析lncRNA对靶向蛋白的结合能力；通过RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀）实验（已知靶蛋白，不知lncRNA），加入靶向蛋白抗体和同型IgG抗体作为阴性对照，通过RT-qPCR靶向蛋白的表达量，分析靶向蛋白对lncRNA的结合能力；EMSA（凝胶迁移实验）来检测已知的蛋白和lncRNA之间的互作关系，用标记的RNA探针和靶蛋白共孵育，党RNA-蛋白复合体形成后，用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离两者，来确定RNA结合蛋白的特异性。在此基础上，可通过相关蛋白的信号通路，进一步检测其他蛋白的表达量，验证lncRNA的表达是否会在多个蛋白间相互作用影响。

（6）lncRNA的编码能力的验证：构建含有肽段的lncRNA载体，即lncRNA-连接肽（如FLAG等），检测肽段是否有表达，可验证其是否有编码能力。

（7）其他：通过lncRNA与mRNA的互作研究，也可通过两者的过表达或敲低表达水平来观察癌细胞的增殖和凋亡能力以及迁移能力，进而为疾病的诊断提供潜在的药物靶点。

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