双荧光素酶系统质粒载体推荐-BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

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简介：

双荧光素酶报告基因检测是通常以萤火虫荧光素(Firefly luciferin，简称Fluc)为报告基因，以海肾荧光素酶(Renilla luciferase，简称Rluc)作为内参基因。Fluc以荧光素(luciferin)为底物，在Mg²⁺、ATP和O₂存在下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin而发出生物荧光(bioluminescence)。在Fluc表达框的上游启动子区域插不同功能序列，可通过转录起始条件造成其荧光的变化；在Fluc的3’UTR区域插入待验证的靶序列，通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低，可以反映是否存在靶向互作。Rluc以腔肠素(coelenterazine)为底物，在O₂存在下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide的过程发出生物荧光；通常由固定组成型启动子驱动，在报告系统中作为校正的内参信号。

双萤光素酶的应用方向
1、验证microRNA同mRNA靶向互作：将待测基因序列插入报告基因载体的3’UTR，再共转入microRNA，检测荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。
2、验证microRNA同lncRNA靶向互作：将待测lncRNA序列插入报告基因载体的3’UTR区域，检测荧光素酶活性。
3、启动子结构分析：将启动子区域(约2k左右)进行分段截短或突变，构建入报告基因载体，检测荧光素酶活性。
4、验证信号通路是否激活：将该信号通路的下游相应原件序列构建入报告基因载体，检测不同上游条件下，其荧光素酶活性，即下游信号通路的响应情况。
5、验证转录因子同其调控序列：将该序列(通常为启动子序列)插入在报告基因载体中，同时在该实验细胞中共转转录因子，分析该转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。
双萤光素酶实验的具体步骤
1、报告基因质粒的构建：将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上；
2、转染细胞：将报告基因质粒和转录因子质粒共转染细胞；
当两种荧光素酶分别在两个载体上共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒:内参转染量一般为10:1~50:1。
3、提取蛋白，用于荧光素酶检测；
4、加入底物，Luciferase活性测定：
⑴ 初次使用时，配制荧光素酶测试试剂LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。
⑵ 加入1X PLB裂解液，室温裂解细胞15 min。
⑶ 配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。
⑷ 测定荧光值：向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。
⑸ 数据处理：首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。

双荧光素酶报告基因检测常用的载体有两种策略：
一、两种荧光素酶位于同一个载体上
哺乳细胞
pmirGLO（microRNA与mRNA，lncRNA靶向互作）
SV40启动子驱动hRluc的表达作为内参，PGK启动子驱动Luc作为报告基因，将待验证的元件克隆至Luc的3’端。
psiCHECK-2（microRNA与mRNA，lncRNA靶向互作）
HSVTK启动子驱动Luc作为内参，SV40启动子驱动hRluc作为报告基因，将待验证的元件克隆至hRluc的3’端。

植物
pGreen II-0800-Luc（启动子检测）
35S启动子驱动hRluc的表达作为内参，Luc作为报告基因，将待验证的启动子序列克隆至Luc的5’端，检测启动子的活性。
pGreenII-0800-miRNA（microRNA与mRNA，lncRNA靶向互作）
35S启动子驱动hRluc的表达作为内参，35S启动子驱动Luc作为报告基因，将待验证的元件克隆至Luc的3’端。
二、两种荧光素分别位于两个载体上：
内参载体pRL系列：可在哺乳细胞中组成型表达海洋腔肠荧光素酶Rluc，提供不同的启动子构型，可与萤火虫荧光素酶载体组合，作为报告基因的内参。在Rluc上游是一个T7启动子，可在体外合成Rluc的转录物。
pGL4.74
pRL-CMV
CMV启动子在多种细胞中可高强度、组成型地表达。
pRL-SV40
SV40启动子在多种细胞中可高强度、组成型地表达。
pRL-TK
HSV-TK启动子在胚胎和成熟的哺乳细胞中，可低水平、组成型地表达。
报告基因载体：将待验证的序列或元件插入到报告基因载体中，根据荧光素酶的活性反映检测的结果。
Luc2基因经过改造，去除大部分隐藏的转录因子结合位点，并通过编码优化提高了在哺乳细胞中的表达效率。Luc2P基因和Luc2CP基因在Luc基因的基础上增加了降解序列，可以调控Luc2基因在细胞中的半衰期，从而使基因对刺激的响应更快，但会影响其信号强度。Luc2基因半衰期为3小时，Luc2P基因半衰期为1小时，Luc2CP基因半衰期为0.4小时；其信号强度相反。
1、验证miRNA与靶基因3’UTR的结合：将靶基因3’UTR序列插入到荧光素酶的后面。
pMIR-Report Luciferase（CMV启动子）
pGL6-miR（PGK启动子）
2、验证miRNA同lncRNA靶向互作：将待测lncRNA序列插入到荧光素酶的前面。
pMIR-Report Luciferase（CMV启动子）
pGL6-miR（PGK启动子）
3、分析启动子/增强子：将启动子区域分段或突变，插入到荧光素酶前面。
pGL4.11[luc2P]
pGL4.14[luc2/Hygro]
pGL6
pGL3-Basic，不含启动子及增强子，将可能的启动子序列克隆到荧光素酶基因的上游，可测定其是否具有启动荧光素酶基因表达的活性。
pGL3-Promoter 含SV40的启动子可驱动荧光素酶基因表达。插入可能的增强子可增加荧光素酶基因的表达。
pGL3-Enhancer，在荧光素酶基因下游插入了SV40增强子，这可用于测定能增强荧光素酶基因表达的启动子。
pGL3-Control：含SV40的启动子及增强子，能产生高水平的荧光素酶基因表达。可作为检测转染频率的阳性对照。
4、验证转录因子同其调控序列：将调控序列（通常为启动子、增强子等调控元件）插入到荧光素酶前面，研究调控序列的基因转录调控活性。
pGL4.26[luc2-minP-Hygro]：
pGL4.27[luc2P minP Hygro]：
5、信号通路研究
Wnt信号通路
TopFlash：（Mini-TK promoter）
TopFlash用于检测Wnt信号通路中β-catenin介导的TCF/LEF转录活性水平，在荧光素上游有两组TCF/LEF结合位点序列，每组有三个重复序列，一组为正向序列，另一组是它的反向互补序列，可以高灵敏度地检测TCF/LEF的转录活性水平。TCF/LEF的转录活性水平与荧光素酶活性成正比，测定Wnt信号通路的激活水平。
FopFlash：（Mini-TK promoter）
FOPFlash质粒：在荧光素酶前面插入突变的TCF/LEF结合位点序列，是TOPFlash的阴性对照报告基因质粒。
pGL4.49[luc2P/TCF-LEF RE/Hygro]：
P53信号通路
pP53-TA-Luc：（TA promoter）
用于检测P53信号通路中P53转录活性水平，在荧光素上游插入P53结合位点序列。
JAK-STAT信号通路
pStat3-TA-Luc：TA promoter）
用于检测JAK-STAT信号通路中STAT3转录活性水平，在荧光素上游插入4个STAT3结合位点序列。
pGL4.52[Luc2P STAT5 RE Hygro]：
pGL4.47[luc2P SIE Hygro]：
SIE：sis-inducible element
pISRE-TA-luc：（TA promoter）
检测ISRE转录活性水平，在荧光素上游插入9个ISRE结合位点序列（GAAACT）。监测 Jak/STAT 介导的信号转导通路中STAT1和STAT2异二聚体的转录，STAT1和STAT2异二聚体与顺式作用的 ISRE 增强子元件结合后，转录被诱导，报告基因被激活。
TGF-β/BMP信号通路
pAP1-Luc：（TA promoter）
用于检测TGF-β信号通路中AP1转录活性水平，在荧光素上游插入6个AP1结合位点序列。
pGL4.48[luc2P SBE Hygro]
SBE：Samd-binding element
cAMP-PKA信号通路
pGL4.29-Luc2P-CRE-Hygro-CMV-EGFP
CRE：cyclic AMP response element，cAMP反应元件，参与多条信号通路；含有3个重复的CRE结合位点序列。
NFκB信号
pNFκB-TA-luc ：用于检测NFκB信号通路中NFκB转录活性水平，在荧光素上游插入2个NFκB结合位点序列(GGGAA TTTCCGGGAA TTTCC)。
其他转录因子
pNFAT-TA-Luc（TA promoter）
用于检测NFAT信号通路中NFAT转录活性水平，在荧光素上游插入NFAT结合位点序列。
pE2F-TA-Luc（TA promoter）
监测 E2F 介导的信号转导途径，E2F是成视网膜细胞瘤基因 (Rb) 的主要靶点，E2F蛋白与DP1蛋白形成异二聚体复合物 E2F/DP1，与顺式作用的 E2F 增强子元件结合后，转录被诱导，报告基因被激活。
pGRE-Luc（TA promoter）
检测GRE糖皮质激素介导的信号通路激活水平，在荧光素上游插入GRE结合位点序列。
pGL4.42[luc2P HRE Hygro]
HRE：hypoxia response element 低氧反应元件，调节相关基因的转录表达，使细胞避免或适应低氧状态；含有4个重复的HRE结合位点序列。
pARE-luc：检测ARE(antioxidant response element，抗氧化响应元件)的转录活性水平，在荧光素上游插入了2个ARE结合位点（ACTGAGGGT GACTCAGCAAAATC），可以用于检测细胞的抗氧化水平或氧化应激状态。

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