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双荧光素酶系统质粒载体推荐-BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

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BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心提供双荧光素酶系统相关质粒


简介:

双荧光素酶报告基因检测是通常以萤火虫荧光素(Firefly luciferin,简称Fluc)为报告基因,以海肾荧光素酶(Renilla luciferase,简称Rluc)作为内参基因。Fluc以荧光素(luciferin)为底物,在Mg2+、ATP和O2存在下,可以催化luciferin氧化成oxyluciferin而发出生物荧光(bioluminescence)。Fluc表达框的上游启动子区域插不同功能序列,可通过转录起始条件造成其荧光的变化;在Fluc3UTR区域插入待验证的靶序列,通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低,可以反映是否存在靶向互作。Rluc以腔肠素(coelenterazine)为底物,在O2存在下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide的过程发出生物荧光;通常由固定组成型启动子驱动,在报告系统中作为校正的内参信号。

双萤光素酶的应用方向
1、验证microRNA同mRNA靶向互作:将待测基因序列插入报告基因载体的3’UTR,再共转入microRNA,检测荧光素酶活性下降,则提示为其靶序列。
2、验证microRNA同lncRNA靶向互作:将待测lncRNA序列插入报告基因载体的3’UTR区域,检测荧光素酶活性。
3、启动子结构分析:将启动子区域(约2k左右)进行分段截短或突变,构建入报告基因载体,检测荧光素酶活性。
4、验证信号通路是否激活:将该信号通路的下游相应原件序列构建入报告基因载体,检测不同上游条件下,其荧光素酶活性,即下游信号通路的响应情况。
5、验证转录因子同其调控序列:将该序列(通常为启动子序列)插入在报告基因载体中,同时在该实验细胞中共转转录因子,分析该转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。
双萤光素酶实验的具体步骤
1、报告基因质粒的构建:将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上;
2、转染细胞:将报告基因质粒和转录因子质粒共转染细胞;
当两种荧光素酶分别在两个载体上共转染时,由于内参具有很强的启动子,因此报告基因质粒:内参转染量一般为10:1~50:1。
3、提取蛋白,用于荧光素酶检测;
4、加入底物,Luciferase活性测定:
⑴ 初次使用时,配制荧光素酶测试试剂LAR II,即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中,并分装-80℃避光保存。
⑵ 加入1X PLB裂解液,室温裂解细胞15 min。
⑶ 配制Stop&Glo,即Renilla luciferase的底物,能够终止LAR II的反应。
⑷ 测定荧光值:向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液,吹打混匀后,检测读数,即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo,再次读数,即为Renilla luciferase的值。
⑸ 数据处理:首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值,再以control组的比值为单位1,即可得到不同处理组的相对luciferase活性,也就是该处理组基因转录的调控活性。

双荧光素酶报告基因检测常用的载体有两种策略:
一、两种荧光素酶位于同一个载体上
哺乳细胞
pmirGLO(microRNA与mRNA,lncRNA靶向互作)
SV40启动子驱动hRluc的表达作为内参,PGK启动子驱动Luc作为报告基因,将待验证的元件克隆至Luc的3’端。
psiCHECK-2(microRNA与mRNA,lncRNA靶向互作)
HSVTK启动子驱动Luc作为内参,SV40启动子驱动hRluc作为报告基因,将待验证的元件克隆至hRluc的3’端。

植物
pGreen II-0800-Luc(启动子检测)
35S启动子驱动hRluc的表达作为内参,Luc作为报告基因,将待验证的启动子序列克隆至Luc的5’端,检测启动子的活性。
pGreenII-0800-miRNA(microRNA与mRNA,lncRNA靶向互作)
35S启动子驱动hRluc的表达作为内参,35S启动子驱动Luc作为报告基因,将待验证的元件克隆至Luc的3’端。
二、两种荧光素分别位于两个载体上:
内参载体pRL系列:可在哺乳细胞中组成型表达海洋腔肠荧光素酶Rluc,提供不同的启动子构型,可与萤火虫荧光素酶载体组合,作为报告基因的内参。在Rluc上游是一个T7启动子,可在体外合成Rluc的转录物。
pGL4.74
pRL-CMV
CMV启动子在多种细胞中可高强度、组成型地表达。
pRL-SV40
SV40启动子在多种细胞中可高强度、组成型地表达。
pRL-TK
HSV-TK启动子在胚胎和成熟的哺乳细胞中,可低水平、组成型地表达。
报告基因载体:将待验证的序列或元件插入到报告基因载体中,根据荧光素酶的活性反映检测的结果。
Luc2基因经过改造,去除大部分隐藏的转录因子结合位点,并通过编码优化提高了在哺乳细胞中的表达效率。Luc2P基因和Luc2CP基因在Luc基因的基础上增加了降解序列,可以调控Luc2基因在细胞中的半衰期,从而使基因对刺激的响应更快,但会影响其信号强度。Luc2基因半衰期为3小时,Luc2P基因半衰期为1小时,Luc2CP基因半衰期为0.4小时;其信号强度相反。
1、验证miRNA与靶基因3’UTR的结合:将靶基因3’UTR序列插入到荧光素酶的后面。
pMIR-Report Luciferase(CMV启动子)
pGL6-miR(PGK启动子)
2、验证miRNA同lncRNA靶向互作:将待测lncRNA序列插入到荧光素酶的前面。
pMIR-Report Luciferase(CMV启动子)
pGL6-miR(PGK启动子)
3、分析启动子/增强子:将启动子区域分段或突变,插入到荧光素酶前面。
pGL4.11[luc2P]
pGL4.14[luc2/Hygro]
pGL6
pGL3-Basic,不含启动子及增强子,将可能的启动子序列克隆到荧光素酶基因的上游,可测定其是否具有启动荧光素酶基因表达的活性。
pGL3-Promoter 含SV40的启动子可驱动荧光素酶基因表达。插入可能的增强子可增加荧光素酶基因的表达。
pGL3-Enhancer,在荧光素酶基因下游插入了SV40增强子,这可用于测定能增强荧光素酶基因表达的启动子。
pGL3-Control:含SV40的启动子及增强子,能产生高水平的荧光素酶基因表达。可作为检测转染频率的阳性对照。
4、验证转录因子同其调控序列:将调控序列(通常为启动子、增强子等调控元件)插入到荧光素酶前面,研究调控序列的基因转录调控活性。
pGL4.26[luc2-minP-Hygro]:
pGL4.27[luc2P minP Hygro]:
5、信号通路研究
Wnt信号通路
TopFlash:(Mini-TK promoter)
TopFlash用于检测Wnt信号通路中β-catenin介导的TCF/LEF转录活性水平,在荧光素上游有两组TCF/LEF结合位点序列,每组有三个重复序列,一组为正向序列,另一组是它的反向互补序列,可以高灵敏度地检测TCF/LEF的转录活性水平。TCF/LEF的转录活性水平与荧光素酶活性成正比,测定Wnt信号通路的激活水平。
FopFlash:(Mini-TK promoter)
FOPFlash质粒:在荧光素酶前面插入突变的TCF/LEF结合位点序列,是TOPFlash的阴性对照报告基因质粒。
pGL4.49[luc2P/TCF-LEF RE/Hygro]:
P53信号通路
pP53-TA-Luc:(TA promoter)
用于检测P53信号通路中P53转录活性水平,在荧光素上游插入P53结合位点序列。
JAK-STAT信号通路
pStat3-TA-Luc:TA promoter)
用于检测JAK-STAT信号通路中STAT3转录活性水平,在荧光素上游插入4个STAT3结合位点序列。
pGL4.52[Luc2P STAT5 RE Hygro]:
pGL4.47[luc2P SIE Hygro]:
SIE:sis-inducible element
pISRE-TA-luc:(TA promoter)
检测ISRE转录活性水平,在荧光素上游插入9个ISRE结合位点序列(GAAACT)。监测 Jak/STAT 介导的信号转导通路中STAT1和STAT2异二聚体的转录,STAT1和STAT2异二聚体与顺式作用的 ISRE 增强子元件结合后,转录被诱导,报告基因被激活。
TGF-β/BMP信号通路
pAP1-Luc:(TA promoter)
用于检测TGF-β信号通路中AP1转录活性水平,在荧光素上游插入6个AP1结合位点序列。
pGL4.48[luc2P SBE Hygro]
SBE:Samd-binding element
cAMP-PKA信号通路
pGL4.29-Luc2P-CRE-Hygro-CMV-EGFP
CRE:cyclic AMP response element,cAMP反应元件,参与多条信号通路;含有3个重复的CRE结合位点序列。
NFκB信号
pNFκB-TA-luc :用于检测NFκB信号通路中NFκB转录活性水平,在荧光素上游插入2个NFκB结合位点序列(GGGAA TTTCCGGGAA TTTCC)。
其他转录因子
pNFAT-TA-Luc(TA promoter)
用于检测NFAT信号通路中NFAT转录活性水平,在荧光素上游插入NFAT结合位点序列。
pE2F-TA-Luc(TA promoter)
监测 E2F 介导的信号转导途径,E2F是成视网膜细胞瘤基因 (Rb) 的主要靶点,E2F蛋白与DP1蛋白形成异二聚体复合物 E2F/DP1,与顺式作用的 E2F 增强子元件结合后,转录被诱导,报告基因被激活。
pGRE-Luc(TA promoter)
检测GRE糖皮质激素介导的信号通路激活水平,在荧光素上游插入GRE结合位点序列。
pGL4.42[luc2P HRE Hygro]
HRE:hypoxia response element 低氧反应元件,调节相关基因的转录表达,使细胞避免或适应低氧状态;含有4个重复的HRE结合位点序列。
pARE-luc:检测ARE(antioxidant response element,抗氧化响应元件)的转录活性水平,在荧光素上游插入了2个ARE结合位点(ACTGAGGGT GACTCAGCAAAATC),可以用于检测细胞的抗氧化水平或氧化应激状态。


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