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发根农杆菌A4,ATCC15834,R1601,Ri601,K599, AR10,MSU440,LBA9402发根农杆菌菌株/感受态细胞-BioVector NTCC保藏中心

  • 价  格:¥5920
  • 货  号:A4,ATCC15834
  • 产  地:北京
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发根农杆菌A4,ATCC15834,R1601,Ri601,K599, AR10,MSU440,LBA9402发根农杆菌菌株/感受态细胞


操作方法

1. -80保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中。

1. 100μl感受态加1ug(体积不大于10ul)质粒DNA,用手拨打管底混匀,依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37水浴5分钟、冰浴5分钟。

3. 加入700μl无抗生素的LBYEB液体培养基,于28振荡培养2~3小时。

4. 6000rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LBYEB平板上,倒置放于28培养箱培养2-3(当平板只含有50ug/ml kan 时,28培养48h即可;平板中同时加入50ug/ml kan20ug/ml rif 时,需28培养60h;如果使用的平板含有50ug/ml rif 则需要28培养72-90h)。








注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。


备注:

1、农杆菌相关抗生素配方:

抗生素

配方

原液

工作液

羧苄青霉素(carb

双蒸水溶解,0.22um滤膜过滤除菌

50mg/ml

50ug/ml

硫酸卡那霉素(kan

双蒸水溶解,0.22um滤膜过滤除菌

50mg/ml

50ug/ml

链霉素(strep

双蒸水溶解,0.22um滤膜过滤除菌

10mg/ml

50ug/ml

利福平(rif

DMSO溶解,0.22um滤膜过滤除菌

10mg/ml

20ug/ml

庆大霉素(gent

双蒸水溶解,0.22um滤膜过滤除菌

20mg/ml

40ug/ml



2、常用农杆菌抗性:(R:抗;S:敏感。)

农杆菌菌株

羧苄青霉素(carb)

链霉素(strep)

利福平(rif)

庆大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

R

R

S

S

EHA105

S

R

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

R

R

R

S



3LBYEB配方:

component

LB(液体)/L

LB(固体)/L

component

YEB(液体)/L

YEB(固体)/L

Tryptone

10g

10g

Tryptone

5g

5g

Yeast extract

5g

5g

Yeast extract

1g

1g

NaCl

10g

10g

牛肉浸膏

5g

5g

NaOH

PH7.0

PH7.0

蔗糖

5g

5g

Agar

15g

MgSO4*7H2O

0.49g

0.49g




NaOH

PH7.0

PH7.0




Agar

15g

注意事项

1、加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10 ;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

2、混入质粒时应轻柔操作。

3、转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4、利福平浓度不应高于25ug/ul,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50ug/ml kan,若所用平板含有20ug/ml rif则转化效率降低到1/2

5、培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。


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