腺相关病毒系统载体及应用方法pAAV-MCS pAAV-RC pAAV-Helper. BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心
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腺相关病毒(AAV)简介-BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心
腺病毒相关病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。
简介：
重组腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒(Ad)或者单纯疱疹病毒(HSV)。基因组两端为末端反向重复序列(ITR)，中间基因组编码两个蛋白：Cap和Rep。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AAVS1位点。这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒。
重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
特点：
优点：以潜伏感染为主；AAV可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。
缺点：AAV载体容量小，目前最多只能容纳4.5kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。
重组腺病毒相关载体构建：
AAV选择的条件：
1.治疗基因的长度不能过大。AAV的总容量4.5kb，还要包括AAV自身的ITR，启动区和RNA加尾信号；
2.基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；
3.长期表达目的基因，没毒副作用；
4.不需要目的基因立刻表达；
5.不需要基因高水平表达；
6.AAV载体对靶细胞具有较高的转导效率。
AAV病毒的感染细胞
AAV载体对于骨骼肌、视网膜、肝细胞、心脏平滑肌细胞、神经元细胞、胰岛B细胞、关节滑膜细胞等具有良好的感染效果，而对于淋巴细胞、造血干细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞等感染效果较差。
腺病毒相关载体应用：
经过十几年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性已被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。目前已发现的AAV至少有十几种血清型，它们主要区别在衣壳蛋白Cap的不同，因此导致各种血清型AAV对不同的组织和细胞的不同感染效率。目前普遍认为，rAAV是最为优秀可用于基因治疗的重组病毒载体。
优点
缺点
AAV选择的条件
AAV病毒的感染细胞
病毒的加样量
病毒要求
病毒级别
腺相关病毒属微小病毒( parvovirus)家族的成员，为无包膜的单链线状DNA病毒。AAV的基因组约4700bp。基因组5‘、3’端各有一个145nt的反向末端重复序列（ITR）。在两个ITR之间存在两个开放阅读框，其中Rep基因参与病毒的复制和整合，Cap基因编码病毒衣壳蛋白。
图1 AAV病毒基因组
腺相关病毒具有安全性高、免疫原性低、能介导基因在动物体内长期稳定表达，因而被认为是最有潜力成为基因治疗工具的载体而在国内外研究中广泛应用。
应用优势：动物和临床试验
AAV进入细胞前，首先要通过衣壳蛋白与细胞表面的相应受体结合，进而附着于细胞表面，随后通过衣壳蛋白与其它复合受体的相互作用来起始病毒颗粒的细胞内转运等生物学活动。AAV不同血清型有不同的衣壳蛋白，进而可与不同的细胞表面受体结合，体现出血清型对不同组织器官的不同亲和性。在包装腺相关病毒时有9种不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见下表。
AAV载体不同血清型
研究发现AAV 具有多种血清型，各种不同血清型的AAV 载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前Biovector NTCC保藏中心在包装腺相关病毒时有 12种不同的 AAV 血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的 AAV 病毒，见表 2。
表1. 12种不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性
血清型 | 组织亲和性 |
AAV1 | 肌肉，心脏，骨骼肌（包括心肌），神经组织 |
AAV2 | 中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼， |
AAV3 | 肌肉，肝脏，肺，眼 |
AAV4 | 中枢神经，肌肉，眼，脑 |
AAV5 | 肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺 |
AAV6 | 肺，心脏 |
AAV7 | 肌肉，肝脏 |
AAV8 | 肝脏，眼，中枢神经，肌肉 |
AAV9 | 心脏，肌肉，肺（肺泡），肝脏，中枢神经 |
DJ | 肝脏，视网膜，肺，肾脏 |
DJ/8 | 肝脏，眼，中枢神经，肌肉 |
Rh10 | 肺, 心脏，肌肉，中枢神经，肝脏 |
AAV生物学特性
表2 不同病毒的生物学特性比较
慢病毒 | 逆转录病毒 | 腺相关病毒 | 腺病毒 | |
包膜 | 有 | 有 | 无 | 无 |
颗粒直径 | 90-100 nm | 90-100 nm | 20-30 nm | 60-90nm |
基因组 | dsRNA | dsRNA | ssDNA | dsDNA |
表达起始时间 | 48-72h | 48-72h | 72-96h | 24-48h |
表达持续时间 | > 2 months | > 2 months | > 6 months | ~1 month |
宿主基因组整合方式 | 随机高频整合 | 随机高频整合 | 定向低频整合或非整合 | 非整合 |
常用质粒：
腺相关病毒可用于基因的过表达（3kb以下）、shRNA（单条或者多条串联）、miRNA（pre-miRNA或者pri-miRNA）、可诱导表达。腺相关病毒载体有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、GFAP等多种启动子可供选择，常用载体如下表。
载体名称 | 包装容量 | 载体用途 |
pAAV-CMV-MCS | <3kb | 过表达 |
pAAV-CMV-MCS-ZsGreen | <2.2kb | 过表达 |
pAAV-CMV-MCS-IRES-ZsGreen | <1.7kb | 过表达 |
pAAV-CMV-MCS-IRES-mCherry | <1.7kb | 过表达 |
pAAV-CAG-MCS | <2.4kb | 过表达 |
pAAV-CAG-IRES-ZsGreen | <1.2kb | 过表达 |
pAAV-ZsGreen-ShRNA | N/A | ShRNA |
pAAV-tdTomato-ShRNA | N/A | ShRNA |
pAAV-CMV-ZsGreen-miRNA | N/A | miRNA |
pAAV-CMV-ZsGreen-MCS | N/A | 过表达/miRNA |
pAAV-MCS Stratagene 腺相关病毒系统 pAAV-RC Stratagene 腺相关病毒系统 pHelper Stratagene 腺相关病毒系统 pAAV-LacZ Stratagene 腺相关病毒系统 pAAV-IRES-hrGFP Stratagene 腺相关病毒系统 pCMV-MCS Stratagene 腺相关病毒系统 pAAV-MCS 过表达AAV载体 pAAV-EGFP GFP标记，空白AAV质粒 pAAV-ZsGreen GFP标记，空白AAV质粒 pAAV-tdTomato RFP标记，空白AAV质粒 pAAV-ZsGreen-ShRNA RNAi AAV载体，带GFP标记 pAAV-tdTomato-ShRNA RNAi AAV载体，带RFP标记 pAAV-IRES-hrGFP 过表达AAV载体，带GFP标记 pAAV-IRES-ZsGreen 过表达AAV载体，带GFP标记 pAAV-IRES-tdTomato 过表达AAV载体，带RFP标记 pAAV-hRK1-IRES-ZsGreen 过表达AAV载体，带GFP标记，带RK1启动子 pHelper AAV系统质粒 pAAV2/1 AAV系统质粒，血清型1型 pAAV2/2 AAV系统质粒，血清型2型 pAAV2/3 AAV系统质粒，血清型3型 pAAV2/4 AAV系统质粒，血清型4型 pAAV2/5 AAV系统质粒，血清型5型 pAAV2/6 AAV系统质粒，血清型6型 pAAV2/7 AAV系统质粒，血清型7型 pAAV2/8 AAV系统质粒，血清型8型 pAAV2/9 AAV系统质粒，血清型9型 pDC316-mCMV-EGFP 过表达腺病毒载体，带GFP标记 pDC316-mCMV-ZsGreen 过表达腺病毒载体，带GFP标记 pDC316-mCMV-tdTomato 过表达腺病毒载体，带RFP标记 pDC316-EGFP-ShRNA RNAi 腺病毒载体，带GFP标记 pDC316-ZsGreen-ShRNA RNAi 腺病毒载体，带GFP标记 pBHG(△E1，E3) Ad5型腺病毒系统质粒 pBGN-ShRNA1 RNAi腺病毒表达载体，带GFP标记 pBGN-ShRNA2 RNAi腺病毒表达载体，带GFP标记 pBGN-ShRNA3 RNAi腺病毒表达载体，带GFP标记 pBGN-ShRNA4 RNAi腺病毒表达载体，带GFP标记 pBGN-ShRNA RNAi表达载体，带GFP标记 pBGN-MiRNA microRNA表达载体，带GFP标记 pBRN-ShRNA RNAi表达载体，带RFP标记 pBIGN-ShRNA RNAi表达载体及过表达载体，带GFP标记
另外，BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心提供腺病毒系统（
AAV应用介绍
A. AAV9感染小鼠脑组织（PMID: 23503602）
B. AAV2感染大鼠脑组织
C. AAV2感染肾脏（PMID: 23216315）
D. AAV感染心脏（PMID: 20703310）
E. AAV9感染骨骼肌（PMID: 21811247）
F. AAV感染肝脏（PMID: 19861950）
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