BioVector® 22Delta10a 酿酒酵母多重氨基酸转运缺陷工程株 / BioVector® 22Delta10a Saccharomyces cerevisiae Multiple Transporter Knockout Strain

1 菌株基本信息与生理表型 / Strain Identification and Physiological Profiling

• 菌株名称 (Strain Name)：BioVector® 22Delta10a 酿酒酵母多重氨基酸转运缺陷工程株 (BioVector® 22Delta10a Saccharomyces cerevisiae Multiple Transporter Knockout Strain)。

• 菌株别名与通用代号 (Synonyms & Alternative Strain Designations)：

  • 22Δ10a Strain

  • 22Delta10a Yeast Mutant

  • 22Δ10a AAP/Permease Null Mutant

  • 22708Δ10a Strain

  • S. cerevisiae 10-Delta Permease Mutant Line

• 种属分类 (Species & Background)：真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），酵母菌纲（Saccharomycetes），酿酒酵母属（Saccharomyces），酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，基质系衍生自 22708 基因工程缺陷库）。

• 基因型与缺陷指纹 (Genotype)：MATa/α (或 MATa) gap1-Δ put4-Δ uga4-Δ can1-Δ alp1-Δ lyp1-Δ dip5-Δ gnp1-Δ agp1-Δ tat1-Δ 等多重质膜氨基酸渗透酶（Permease）基因精准敲除株系。

• 生长与菌落表型 (Growth & Colony Profile)：单细胞真核生物，出芽繁殖（Budding yeast）。在富集 YPD 固体平板上形成圆形、表面光滑、边缘整齐、乳白色的经典酵母菌落；在氨基酸选择性合成缺失培养基（SC/SD Base）中表现出极严格的特定氨基酸摄取缺陷表型。

• 安全等级 (Biosafety Level)：1 级安全控制（BSL-1，体外科研与膜转运蛋白功能重组专用）。

2 分子遗传学特征与异源氨基酸/肽类转运蛋白功能重组筛选模型价值 / Molecular Dynamics and Transporter Assay Models

BioVector® 22Delta10a（又称 22Δ10a）菌株是膜转运蛋白生物学（Membrane Transporter Biology）、植物/动物/真菌源氨基酸渗透酶异源功能互补试验（Heterologous Functional Complementary Assay）、底物专一性动力学分析以及转运抑制剂高通量筛选中公认的“内源背景零干扰标杆工程菌株”：

The BioVector® 22Delta10a strain (synonym: 22Δ10a) serves as the universal null-background reference model for heterologous expression, functional complementation, and substrate specificity characterization of eukaryotic amino acid transporters:

核心多重转运体 Knockout 背景 (Null-Background Permease Knockouts)

作为消除内源高亲和力与低亲和力氨基酸转运干预的经典底盘，该株系在基因组层面展现出严格的基因敲除指纹：

• 十重/多重渗透酶基因缺失（10-Delta Knockout Fingerprint）：通过同源重组连续敲除了包括通用氨基酸通透酶 GAP1、脯氨酸转运体 PUT4、GABA 转运体 UGA4、碱性氨基酸转运体（CAN1, ALP1, LYP1）以及广谱低亲和力转运体（AGP1, GNP1, TAT1, DIP5）在内的核心编码基因。

• Zero-Background 异源功能互补 (Clean Heterologous Screening)：由于细胞膜上完全丧失了对多种游离氨基酸（如 L-脯氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸等）的内源摄取能力，外源转入的目标转运蛋白基因（如植物 AAP/LHT 基因族）成为细胞吸收对应氨基酸作为唯一氮源或生长补剂的唯一通道，彻底消除了背景假阳性干预。(Engineered with continuous targeted deletions of up to 10 endogenous amino acid permease genes, establishing an ultraclean background devoid of endogenous uptake interfering pathways.)

3 菌株完全培养基配方与氮源/氨基酸加压筛选栽培规范 / Routine Culturing and Selection Formulations

核心红线规程 / Ammonium Repression and Amino Acid Nitrogen Baseline Notice

22Delta10a 菌株在进行异源转运蛋白功能补救实验时，对培养基中的氮源类型及铵盐（$\text{NH}_4^+$）浓度极度敏感。日常富集可采用 YPD 培养基；但在功能互补与生长筛选阶段，必须完全使用 BioVector® 专有无氨基酸酵母氮源基础培养基（YNB without Amino Acids and Ammonium Sulfate），并严格按需添加 BioVector® 特异性单一氨基酸或特定氮源加压补剂。绝对禁止在互补筛选培养基中混入未定义的蛋白胨、酵母粉或杂质氨基酸，否则会导致筛选压力瞬间失效或假阳性菌落爆破。(Enforce strict nutritional pressure: functional complementation assays demand nitrogen-defined BioVector® YNB media with targeted single amino acid sources to validate heterologous transporter uptake.)

基础与完全培养基组分配方 / Complete Growth Media Formulations

• 1. 日常无压力高密度富集培养基 (YPD Medium for Maintenance)：

  • BioVector® Yeast Extract Base（特级酵母膏）：10 g/L

  • BioVector® Peptone Supplement（特级蛋白胨）：20 g/L

  • BioVector® D-Glucose Base（无水葡萄糖）：20 g/L

• 2. 质粒筛选与氨基酸转运互补合成培养基 (BioVector® SD/SC Functional Selection Medium)：

  • BioVector® YNB Base without Amino Acids & Ammonium Sulfate（无氨基酸与铵盐 YNB 基础）：1.7 g/L

  • BioVector® Nitrogen Source Supplement（指定氮源：如 10 mM 硫酸铵或特定单氨基酸）：按实验精确配比

  • BioVector® Carbon Source Supplement (D-Glucose / D-Galactose)（葡萄糖/半乳糖诱导补剂）：20 g/L

  • BioVector® SC Dropout Amino Acid Supplement Mix（按需缺失氨基酸混合补剂，用于维持质粒）：终浓度 2 g/L

标准物理培养环境 (Incubation Parameters)

• 气体与温度控制 (Incubation Setup)：常规恒温加湿摇床，运行工作温度精密锁定在 30 摄氏度（注：非 37 摄氏度），200 至 220 rpm 振荡培养；固体平板倒置于 30 摄氏度孵箱培养 48 至 72 小时。

4 菌株冻存管复苏、感受态制备与冷冻保存工作流 / Thawing, Expansion, and Cryopreservation Workflows

A 阶段：菌种库冻存管的解冻复苏启动 / Phase A: Strain Thawing and Recovery

1. 从零下 80 摄氏度冰箱或液氮罐中移出 BioVector® 22Delta10a 菌种冻存管，置于冰上融化。

2. 在无菌超净台内，使用无菌接种环挑取少许菌液，划线接种于 BioVector® YPD 固体平板 上。

3. 将平板倒置放入 30 摄氏度 恒温孵箱中，培养 48 小时直至长出清晰的圆润单菌落。

B 阶段：高转化效率 LiAc 感受态细胞制备 / Phase B: Competent Cell Preparation

1. 从 YPD 平板上挑取单克隆接种至 5 mL BioVector® YPD 液体培养基 中，30 摄氏度 200 rpm 培养过夜。

2. 按 1:50 稀释转接至 50 mL 新鲜 YPD 培养基中，30 摄氏度培养至对数生长期（$\text{OD}_{600} \approx 0.6\text{--}0.8$）。

3. 使用 BioVector® High-Efficiency Yeast Transformation Kit（高效酵母转化试剂盒） 离心收集菌体，用无菌醋酸锂（LiAc/TE）缓冲液洗涤并悬浮，制成高效转化感受态细胞。

C 阶段：高品质菌种库甘油冷冻保存建立 / Phase C: Safe Cryopreservation

1. 收集对数生长盛期的 22Delta10a 液体菌液。

2. 加入等体积 BioVector® Sterile 30% Glycerol Preservation Medium（无菌 30% 甘油保护液）（终浓度 15% 甘油）。

3. 充分混匀后分装入无菌防爆螺口冻存管，立刻移入零下 80 摄氏度超低温冰箱长期保存。

5 支原体/杂菌监控与多重敲除基因型 PCR 鉴定及氨基酸摄取零背景（Uptake Rate $\approx 0.00\%$）一票否决制质控红线 / Downstream Quality Control Metrics

菌种纯度与细菌/野生型杂菌常规筛查 (Purity Surveillance)

22Delta10a 生长速率稍慢于野生型酵母，极易被大肠杆菌或野生型 S. cerevisiae 污染。必须定期使用 BioVector® Yeast Genotyping PCR Kit 验证 gap1-Δ 及 can1-Δ 等突变基因座的破坏全长条带。

氨基酸摄取零背景（Endogenous Background Uptake $\le 1.00\%$）与多重基因敲除纯度一票否决制双质控红线 (Functional Zero-Background Gatekeeper)

为了阻断由于长期连续传代导致工程菌株发生基因组自发突变、转运体基因回复突变（Reversion）、或混入内源摄取正常的野生型酵母致使转运筛选全盘失效的灾难性后果，质控部门或研究人员必须在菌株扩增与功能实验前，执行硬性的“基因型-摄取零背景”双重一票否决制质控：

1. 多重 Knockout 基因型验证质控红线：使用 BioVector® Strain Genotyping PCR Kit 对 GAP1, CAN1, PUT4, UGA4 等缺失基因座进行 PCR 校验，必须 100% 呈现缺失片段大小，无任何野生型完整扩增条带。

2. 氨基酸摄取零背景质控红线（核心考核）：使用同位素标记或 BioVector® Amino Acid Uptake Fluorometric Assay Kit 测定未转化空载体菌株对 L-脯氨酸/L-精氨酸的吸收速率。其内源背景吸收率必须严格低于底线 $\le 1.00\%$（相比于野生型对照组，表现为绝对的吸收停滞）。

3. 一票否决处理规范：一旦质控检测发现基因座回复突变，或 内源氨基酸摄取背景背景值突破 1.00% 门槛线（出现背景假阳性生长），该生产或实验批次菌株执行一票否决红线制，全盘作废彻底高压灭菌销毁（121 摄氏度，20 分钟）。绝对禁止将背景泄漏或基因型回复的工程菌株投入下游异源转运蛋白功能互补或抑制剂筛选。必须立刻重新复苏原始极低代次的 BioVector® 22Delta10a 种子甘油管重新开启扩增与质控循环。(Enforce a rigid, non-negotiable functional gatekeeper: 22Delta10a reference stocks must strictly verify 100% multigene knockout integrity paired with an endogenous amino acid background uptake level $\le 1.00\%$. Any background complementation leakage or gene reversion triggers an immediate system veto to destroy running culture batches instantly.)

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